[发明专利]一种去除西瓜叶片Rubisco酶干扰，分离剩余低丰度蛋白质的电泳方法

权利要求书

1.一种简便、有效、快速去除西瓜叶片Rubisco的方法，其特征在于利用18％(w/v)的PEG-4000去除西瓜叶片中的Rubisco。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法具体为采集西瓜成熟叶片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒径为0.01mm～0.05mm粉末，迅速转至离心管中，在离心管中按体积比1∶3加入预冷匀浆缓冲液后混匀，将离心管水平置于冰上孵育10分钟，4℃下于1500g，离心3分钟，弃沉淀，保留上清，4℃下于1,5000g，离心20分钟，弃沉淀，保留上清；在上清液中加入18％的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4℃下于1,5000g，离心25分钟，弃沉淀，保留上清。

3.一种去除西瓜叶片Rubisco干扰，分离剩余蛋白质的方法，其特征在于先利用18％(w/v)的PEG-4000去除西瓜叶片中的Rubisco，再通过TCA-丙酮沉淀法来抽提剩余蛋白质，最后再利用双向电泳分离西瓜叶片剩余蛋白质。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

A)采集西瓜成熟叶片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒径为0.01mm～0.05mm粉末，迅速转至离心管中，在离心管中按体积比1∶3加入预冷匀浆缓冲液后混匀，将离心管水平置于冰上孵育10分钟，4℃下于1500g，离心3分钟，弃沉淀，保留上清，4℃下于1,5000g，离心20分钟，弃沉淀，保留上清；

B)在上清液中加入18％的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4℃下于1,5000g，离心25分钟，弃沉淀，保留上清；

C)在提取的上清中加入8倍体积的10％(w/v)三氯乙酸-丙酮溶液，于-20℃放置过夜，所述的10％(w/v)三氯乙酸-丙酮溶液中含有0.07％的β-巯基乙醇；

D)取出离心管，4℃下于2,5000g，离心25分钟，弃上清，保留沉淀，加入含8ml 0.07％的β-巯基乙醇的丙酮溶液清洗沉淀，于-20℃放置1小时，于4℃下2,5000g，离心25分钟，弃上清，保留沉淀；重复上述洗涤离心操作4次至离心管中蛋白质沉淀发白，无杂色，弃上清，保留沉淀；

E)将留有沉淀的离心管置于通风橱中，室温下干燥20-30分钟，得蛋白粉末；

F)在含有蛋白粉末的离心管中加入裂解液，室温下放置40-60分钟；

G)4℃下于3,0000g，离心30分钟，弃沉淀，保留上清，置于-80℃保存备用；

H)对步骤G所得上清先进行等电聚焦电泳，再进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5.根据权利要求4所述的方法，步骤A中所述的匀浆缓冲液为0.5M的Tris-HCl(pH 8.3)，含2％(v/v)的NP-40，20mM MgCl2，2％(v/v)的β-巯基乙醇和1％(v/v)的PMSF。

6.根据权利要求4所述的方法，步骤F中所述的裂解液含8M尿素，1M硫脲，2％的CHAPS，65mM DTT，0.08％的IPG buffer(pH4-7)。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述等电聚焦电泳中，蛋白质上样量为800ug/18cm胶条，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶浓度为12.5％，采用的染色方法为常规考马斯亮蓝R-250方法。