[发明专利]东亚钳蝎蝎毒中的GPCR活性多肽及其提取分离和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种从东亚钳蝎蝎毒中分离得到的新的活性多肽及其分离纯化方法和应用。

背景技术

蝎子属节肢动物门，蛛形纲，蝎目，钳蝎科。蝎子的药用始载于《开宝本草》，《本草纲目，为中医珍贵药材，具有息风镇痉，攻毒散结，通络止痛的功效，可用于小儿惊风，抽搐痉挛，中风口歪，半身不遂，破伤风，风湿顽痹，偏正头痛，疮疡，瘰疬等疾病的治疗。

我国境内的主要的蝎种是东亚钳蝎，分布于长江以北至辽宁铁岭等地区。对东亚钳蝎蝎毒的研究表明，该毒液中含多种蝎毒素，包括昆虫类神经毒素，甲壳类神经毒素，哺乳动物神经毒素，抗癫痫活性的多肽，镇痛活性多肽等，能特异性作用于各种离子通道。因此，东亚钳蝎蝎毒中的这些大量的活性多肽，是新药发现的一个重要来源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从东亚钳蝎蝎毒中分离得到的活性多肽及其分离方法，以及该活性多肽具有μ-，δ-和κ-阿片受体活性。

本发明所提供的活性多肽序列是利用质谱方法测得其氨基酸序列的，序列为Tyr-Gly-Gly-Tyr-Met-Asn-Pro-Ala-amide，该多肽的C-端被酰胺化，分子量870.3088Da，命名为BmK-YA。以及在其基础上氨基酸改造的活性多肽Phe⁴-BmK-YA，序列为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Asn-Pro-Ala-amide。这两个多肽都为一级线性结构多肽。

本发明所提供的活性多肽BmK-YA的分离方法为：

a.将冻干的东亚钳蝎蝎毒用5％乙腈(含0.1％TFA)溶解，然后上样至C18固相萃取柱进行固相萃取，收集洗脱液并且冻干。

b.将上述冻干样品溶解于5％乙腈(含0.1％TFA)，并用反相色谱C18(XTerra MS C18，长100mm，直径19mm，Waters公司产品)进行第一维粗分离，收集活性组分并冻干(参考图1)。

c.将冻干的活性组分样品溶解于50％乙腈，用亲水作用色谱柱ClickMaltose(长150mm，直径4.6mm.，大连思谱精工有限公司产品)进行分离得到活性多肽(参考图2)。

本发明所提供的多肽BmK-YA和Phe⁴-BmK-YA，在表达了阿片受体的稳定细胞株上进行检测发现具有阿片受体活性：BmK-YA对δ-阿片受体的活性为2.6μM，μ-阿片受体的活性为17μM，κ-阿片受体的活性为30μM.Phe⁴-BmK-YA对δ-阿片受体的活性为157nM，μ-阿片受体的活性为57nM，κ-阿片受体的活性为77nM.

附图说明

图1为第一维反相色谱分离的色谱图：带*号的峰为活性组分。

图2为第二维亲水色谱分离的色谱图：箭头标出的为活性多肽BmK-YA的色谱峰。

图3为活性多肽的二级MSMS谱图及氨基酸序列分析图。

图4为合成的BmK-YA对HEK293T内Ca²⁺浓度的剂量效应曲线。

图5为合成的Phe⁴-BmK-YA对HEK293T内Ca²⁺浓度的剂量效应曲线。

具体实施方式

本发明从东亚钳蝎蝎毒中分离的新结构多肽，并对其G-蛋白偶联受体(GPCR)活性进行测定。应用RPLC-HILIC二维液相色谱联用方法从该毒素中纯化分离出一个由8个氨基酸组成的多肽BmK-YA，质谱法测得该肽的序列为Tyr-Gly-Gly-Tyr-Met-Asn-Pro-Ala-amide，分子量为870.3088Da，并用钙离子测定法测定了该多肽的GPCR活性。根据其序列组成，对此活性多肽进行了结构改造，合成了另一活性多肽Phe⁴-BmK-YA，序列为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Asn-Pro-Ala-amide。本发明中的BmK-YA和Phe⁴-BmK-YA均具有μ-，δ-和κ-阿片受体活性，具有作为镇痛药的前景。

1.东亚钳蝎蝎毒活性多肽BmK-YA的纯化分离