[发明专利]基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于滚环扩增的比色检测靶核酸或蛋白的方法，属于生物大分子的检测领域。

背景技术

快速、特异、高通量的生物分子检测方法在医疗以及生物安全领域对病原微生物以及遗传性疾病的诊断具有重要意义。直接从样本中高灵敏的检测低浓度的生物分子在检验医学、病理学、流行病学、环境及食品检测等大量领域具有广泛而潜在的应用。目前，最广泛应用的扩增方法主要是聚合酶链反应(PCR)，PCR技术可以实现10个DNA分子的扩增，具有很高的灵敏度和专一性，然而其主要缺点在于需要使用复杂的设备，反应过程需要精确的控温，对实验条件的要求较高，极易造成污染，不适合现场使用。

滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)是近些年发展起来的一种等温信号扩增方法，其线性扩增倍数为10⁵。滚环扩增过程始于一条线性DNA单链引物和环形单链模板的杂交，引物在DNA聚合酶的作用下延伸，形成一条具有大量重复序列且与环状模板链完全互补的线状单链。RCA技术正成为一种多功能的DNA扩增工具被广泛应用于基因组、蛋白组、诊断、生物传感、药物研发、纳米技术等研究领域。目前基于滚环扩增的一些检测，均较为复杂，需要昂贵的仪器，如芯片检测(全基因组滚环扩增及其产物的固定方法，专利号：200610096842，电泳检测(用滚环扩增法扩增寡核苷酸，专利号：200480027696.1)以及拉曼光谱检测等(通过滚环扩增和SEBS检测进行的生物分子分析，专利号：200480001922.9)，显然这些方法均不能适应于现场的快速检测。

纳米金粒子具有独特的光学、电学性质及生物相容性，且制备简单、化学性质稳定、易于生物分子的固定修饰等的优点，广泛应用于纳米生物传感器和疾病的诊疗中。由于纳米金的表面等离子体吸收的作用，宏观上，单分散的纳米金颗粒间的平均间距大于1000纳米，临近颗粒偶极子间无重叠，使溶液呈现红色，但颗粒间距减小到小于纳米金粒径时，溶液颜色会发生明显的改变。研究者们利用这种距离依赖的颜色变化开发了一系列溶胶颗粒免疫分析方法用于检测尿液和血清中的靶标蛋白。也有研究者利用纳米金在盐溶液的诱导下对DNA扩增产物片段大小和量的多少产生不同被DNA双链及单个碱基的稳定性而呈现出不同颜色的方法变化对多种样品进行单碱基错配滚环扩增产物进行的检测，并且检测灵敏度高(达到pM)，无需昂贵仪器，可达到了简单、快速、可视化的检测目的。

本发明试图利用未标记的纳米金粒子结合上述近年来发展起来的滚环扩增方法，利用比色检测靶核酸或蛋白，引导出本申请的构思。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于滚环扩增的比色检测靶核酸或蛋白的方法，以解决现有技术中存在的缺陷。

本发明涉及一种快速检测核酸或蛋白的技术平台，利用恒温滚环扩增产生的大量重复序列的单链DNA暴露在纳米金溶液中所产生颜色的变化，通过肉眼观察以及测定其紫外吸收值从而实现对靶核酸或蛋白的微量检测。其主要原理是滚环扩增的大分子产物团聚在一起，表面的负离子堆积程度高，对纳米金颗粒表面的负电荷有屏蔽作用，导致纳米金颗粒间排斥减弱，容易发生聚集，溶液的颜色由原来酒红色逐渐转变为紫黑色。而无扩增产物的溶液或产物较少的溶液颜色变化较小。

本发明所述的一种基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法，其特征在于利用核酸之间的杂交反应以及抗原抗体结合将所要检测的靶核酸或蛋白的捕获探针或捕获抗体间接固定于磁珠上或固态支持物上，然后加入滚环成分，通过杂交上的滚环引物进行恒温滚环扩增，产生的大量重复序列的单链DNA大分子产物，最终通过纳米金的颜色反应检测恒温扩增的大分子产物，以达到相对检测靶核酸及蛋白的目的。

本发明所述的一种基于滚环扩增比色检测靶核酸和蛋白的方法，包括：

1.一种基于滚环扩增比色检测靶核酸的方法

(1)将待检测靶核酸的捕捉探针固定到磁珠或固态支持物上；

(2)设计针对核酸检测的报告引物探针，其5’端序列与待测核酸靶序列3’端互补，3’端具有和环形模板互补的序列，能作为引物针对滚环模板进行恒温滚环扩增；

(3)捕获探针和报告引物探针可与待检测的目标核酸分子进行三明治杂交，报告引物探针的3’端序列作为环形模板的引物对环形模板进行扩增；

(4)通过纳米金溶液颜色反应检测扩增产物来达到对待测核酸分子的相对定量检测。

所述步骤(1)中待检测的目标核酸是指RNA或DNA；