[发明专利]基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法

权利要求书

1.一种基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法，其特征在于利用核酸之间的杂交反应和抗原抗体结合将所要检测的靶核酸或蛋白的捕获探针或捕获抗体间接固定于磁珠上或固态支持物上，然后加入滚环成分，通过杂交上的滚环引物进行恒温滚环扩增，产生的大量重复序列的单链DNA大分子产物，最终通过纳米金的颜色反应检测恒温扩增的大分子产物，以达到相对检测靶核酸及蛋白的目的。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于检测靶核酸的具体步骤是：

(1)探针及引物的设计

(a)捕获探针：5′端以羧基(-COOH)修饰，3’端连接与待测靶核酸5’端互补的一段序列；

(b)报告引物探针：设计针对目标靶核酸检测的报告引物探针，其5’端序列与待测核酸靶序列3’端互补，3’端一段序列与环形模板互补，作为引物针对滚环模板进行恒温滚环扩增；

(c)末端磷酸化的线性ssDNA：通过连接酶的作用形成环形模板；

(2)将待检测核酸的捕捉探针固定到磁珠或固态支持物上；

(3)捕获探针和报告引物探针可与待检测的目标核酸分子进行三明治杂交，报告引物探针的3’端序列作为环形模板的引物对环形模板进行扩增；

(4)通过纳米金溶液颜色反应检测扩增产物，达到对待测目标核酸分子的相对定量检测；

其中，①所述的待检测的目标靶核酸是指RNA或DNA；

②所述的捕获探针5’羧基(-COOH)端连接3个(CH2)及10个T以减少探针杂交时的空间位阻5′-COOH-(CH2)3-(T)10-；

③捕捉探针固定的固态支持物包括：磁珠，硅片，玻片，硅纳米线，石墨烯，碳纳米管或电极；

④报告引物探针的5’端序列与3’端序列之间以poly(T)10-15连接以减少反应时的空间位阻；

⑤所述的环形模板是末端磷酸化的线性ssDNA通过连接酶的作用形成； 

⑥所述的滚环扩增指线性滚环扩增或指数滚环扩增；

⑦所述的纳米金溶液颜色检测是将扩增产物暴露于纳米金溶液中；通过观察扩增产物引起的纳米金溶液颜色变化，以间接检测出目标靶核酸的相对定量。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于基于核酸滚环扩增的步骤包括：

(A)磁珠上捕获探针的标记

取50μL未标记的氨基磁珠，加入50μL浓度为0.1mol/L，PH 4.6的MES，清洗两次，磁分离，弃上清；加入40μL的MES和10μL的羧基修饰的捕获探针，充分混匀；配制浓度为20g/L的EDC和30g/L的NHS各100μL，各取60μL加入到磁珠溶液中，充分混匀，室温震荡下孵育2小时；加入100mmol/L的羟胺20μL，混匀，室温下震荡15min以终止反应；先用100μL的PBS(含0.5％BSA，PH 7.4)洗2次，弃上清；最后用100μL含0.1％BSA，PH 7.4的PBS重悬，4℃下保存备用；

(B)线性环模板ssDNA的环化

10μmol/L ssDNA 1μL，10×CircLigase ssDNA连接酶缓冲液2μL，50mmol/L MnCl₂1μL，1mmol/L ATP 1μL，100U/μLCircLigase ssDNA连接酶1μL，Sterilized ddH₂O 14μL，60℃反应3h，再于80℃作用10min灭活CircLigase ssDNA连接酶；鉴于反应体系中存在未环化的ssDNA，以及反应过程中DNA可能形成的二级结构，向上述反应体系中加入Exonuclease I混合液和Exonuclease III混合液，并加入Sterilized ddH₂O 1.5μL补足至30μL，37℃反应45min，予以去除，再于80℃反应15min将外切酶灭活，连接成功的环状模板于-20℃储存备用；

(C)滚环扩增及检测：

平行做两组实验，每组分别取标记有捕获探针的磁珠、靶核酸、信号报告探针、PBS，30℃杂交15min，磁分离，弃上清，1×phi29缓冲液洗2次；加入等量1×phi29缓冲液和环状模板，混匀，30℃杂交15min，磁分离，弃上清，1×phi29缓冲液洗1-2次。再用1×phi29缓冲液重悬，加入RCA组分，10×phi29缓冲液、10mmol/L的dNTP、2％的BSA、phi29聚合酶(8U)、水共20μL体系，混匀，一组置于37℃扩增120min，另一组于-20℃保存 120min；将两组95℃变性5min使产物从磁上脱离下来，立即磁分离，收集上清；置于-20℃保存备用；

取三管制备好的纳米金溶液，第一管为纳米金溶液原液；第二管为等量的纳米金溶液及扩增出大分子产物体积的溶液，此大分子产物为37℃下扩增的阳性的扩增产物；第三管为等量纳米金溶液加入没有扩增出大分子产物的溶液，该产物为加入各组分后没有在37℃扩增，而是在-20℃放置120min的产物，以做同等条件下的阴性对照；将上述溶液混匀，观察其颜色变化并测其吸光度值；

其中，所述的羧基修饰的捕获探针的浓度为94.2mg/L，标记到磁珠上后，磁珠上捕获探针的浓度为18.9mg/L；

所述的连接成环状的ssDNA经酶切后，纯的环状DNA的浓度为175mg/L；

所述的待检测的靶核酸为H1N1核酸；

所述的Exonuclease I混合液为5U/μL Exonuclease I 2μL，10×ExonucleaseI缓冲液3μL；

所述的Exonuclease III混合液为200U/μL ExonucleaseIII 0.5μL，10×ExonucleaseIII缓冲液3μL。