[发明专利]犬瘟热弱毒疫苗株F和H基因重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H或HA)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-CDVR-F或rLa-CDVR-H。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备疫苗/试剂盒中的应用。

背景技术

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)感染引起的急性、高度接触性传染病。该病不但可以感染犬科动物，还能感染鼬科、浣熊科和猫科等多种动物，发病率高，几乎可以达到100％，且临床症状多样，容易发生细菌、病毒的混合感染和继发二次感染，死亡率更是可高达80％，素有“毁灭性传染病”之称^[1]。近年来，Mee等从患Pagets疾病的病人组织中检测出犬瘟热病毒核酸^[2]，使得犬瘟热成为继狂犬病之后人畜共患的第二种疫病，引起了动物病毒学界及医学界的普遍关注。

犬瘟热病毒(canine distemp virus，CDV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，为单股不分节段的负链RNA病毒，其基因组长15690bp，编码N、P、M、F、H、L和C蛋白。融合蛋白(fusion protein，F)，是位于CDV囊膜上的I型糖蛋白，介导病毒与感染细胞、感染细胞与非感染细胞间的融合，使病毒具有在宿主体内扩散的能力。研究发现虽然针对F蛋白的单抗不能完全中和CDV，但其诱导的免疫反应能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情况下抑制症状的发生^[3]。附着或血凝素蛋白(attachment protein or hemagglutinin protein，H或HA)，是CDV囊膜表面上典型的II型糖蛋白，诱导机体产生中和抗体，是抗犬瘟热病毒免疫的主要抗原。抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体具有病毒中和活性，对试验鼠的保护力强于抗F蛋白的单克隆抗体^[4]。病毒通过H蛋白吸附到细胞表面的受体上，因此，H蛋白决定了犬瘟热病毒宿主的特异性，并协助F蛋白使犬瘟热病毒以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞^[5]。F、H是产生中和抗体的重要抗原之一，在病毒免疫中占有重要地位。

CD是可以预防的，主要通过给幼犬接种犬瘟热弱毒苗进行免疫，但由于母源抗体的存在会直接干扰免疫效果，常常导致免疫失败。因此研制不受犬只已有抗体干扰的疫苗产品迫在眉睫。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔拯救(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(申请号200510097997.8，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功拯救了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及NDV病毒相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容

针对上述研究背景，本发明人为研制更安全有效、生产成本低廉的犬瘟热活载体疫苗，在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上，构建出表达犬瘟热弱毒疫苗株Rockborn-20/8F或H蛋白的重组病毒rLa-CDVR-F或rLa-CDVR-H，通过Western-blot和免疫荧光试验验证犬瘟热融合蛋白和血凝素蛋白的正确表达，进行两株重组病毒的毒力检测，并通过对小鼠和犬的免疫试验对其免疫原性进行研究和评价。