[发明专利]一种同时检测玉米和花生中四种真菌毒素的悬浮芯片检测方法

权利要求书

1.一种多真菌毒素定量检测的悬浮芯片方法，由羧基化微球、偶联于微球上的蛋白检测指标及其对应的单抗指标等组成。其特征在于，所述微球表面的蛋白检测指标包括：黄曲霉毒素总量、呕吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮四种真菌毒素的完全抗原，均通过EDC法共价偶联于羧基化的微球表面。

2.权利要求书1所述的羧基化微球是一种直径为5.6μm的聚苯乙烯微球，微球带有两种荧光物质，根据两种荧光物质的浓度配比不同，可以将微球分成100种。微球表面上的羧基通过EDC法与蛋白检测指标上的氨基进行共价结合，且是液相反应体系，有利于保持蛋白分子的生物活性。

3.根据权利要求1所述的四种真菌毒素的完全抗原，即四种小分子与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物，依次为：黄曲霉毒素总量完全抗原(AFT-BSA)、呕吐毒素完全抗原(DON-BSA)、T-2毒素完全抗原(T-2-BSA)和玉米赤霉烯酮完全抗原(ZEN-BSA)。

4.根据权利要求1所述的小分子鼠源单克隆抗体依次为：抗黄曲霉毒素总量单克隆抗体(AFT-Ab)、抗呕吐毒素单克隆抗体(DON-Ab)、抗T-2毒素单克隆抗体(T-2-Ab)、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体(ZEN-Ab)。

5.根据权利要求3所述的四种真菌毒素半抗原依次是黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)、T-2毒素(T-2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)。

6.制备权利要求1所述悬浮芯片法中各完全抗原与微球偶联包括以下步骤：

(1)将空白的羧基化微球从4℃冰箱取出，于暗环境中将其恢复至室温，再将其进行活化；

(2)按实验设计的浓度配制各完全抗原溶液，通过EDC法与羧基化微球偶联，即各完全抗原与微球的偶联物，并对其进行封闭；

(3)将偶联物涡旋振荡后，用悬浮芯片仪对其进行读数。其余的用铝箔纸包裹，于4℃储存。

注：本发明的所有操作过程均在暗环境下进行。

7.根据权利要求5，进行悬浮芯片实验时，应先将偶联物和悬浮芯片所用的各种缓冲液从4℃冰箱取出，恢复至室温后启用。

8.本发明所采用的是间接竞争免疫反应，主要分为五个阶段的工作：

(1)四种真菌毒素完全抗原分别与不同编码微球的偶联；

(2)四种真菌毒素单抗和生物素化二抗最佳工作浓度的确定，以及抗原抗体之间特异性的验证；

(3)同时检测四种真菌毒素时多通道标准曲线的建立；

(4)同时检测玉米、花生中四种真菌毒素悬浮芯片方法的建立；

(5)悬浮芯片法检测玉米、花生的准确性和重复性研究。

9.根据权利要求8中(2)，按设定的浓度配制各单抗与生物素化二抗的工作浓度溶液，进行棋盘优化，得出各抗体最佳的工作浓度，并对各抗原抗体进行特异性检测。

10.根据权利要求8中(3)，按照优化后的各抗体最佳的工作浓度溶液进行配制，并按设定的一系列浓度配制各半抗原的混合溶液，使其与完全抗原竞争有限的抗体结合位点，绘制出同时检测四种真菌毒素的多通道标准曲线。

11.根据权利要求8中(4)，将从当地市场购得的玉米和花生样品用一定比例的甲醇/水溶液进行前处理，并将阴性提取液进行稀释。以此玉米阴性样液和花生阴性样液为稀释液，按最佳工作浓度配制抗体溶液，以及一系列浓度的半抗原混合液，使其与相应偶联物进行竞争免疫反应，以绘制出玉米和花生中检测四种真菌毒素的多通道标准曲线，通过对MFI₀(阳性对照)和IC₅₀进行比较分析，从而对基质效应进行评价。

12.根据权利要求8中(5)，通过对实际样品的加标检测结果进行分析，评价检测的重复性和准确性，从而得出悬浮芯片法可同时检测玉米和花生样品中的四种真菌毒素。