[发明专利]一种从鸡蛋中同时提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留的方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种鸡蛋中氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)及代谢物氟苯尼考胺(FFA)同时提取、净化的方法。

背景技术

在对食品残留物进行检测时，如果能同时对多种物质进行检测，那么将大大提高工作效率，但只有同时能将多种残留物同时从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。氯霉素类药物主要包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等，以其广谱、高效等特点，被广泛应用于人医与兽医。然而由于其不同的毒性作用在世界范围内被广泛监测。目前国内外关于氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的提取方法有许多报道，提取剂一般为乙酸乙酯、乙腈、丙酮等。然而国内外对鸡蛋中该四种药物同时提取的方法未见报道。本试验采用乙酸乙酯∶乙腈∶氨水(49∶49∶2，V/V)作为提取剂，饱和正己烷去脂和净化，提取效率较高。

发明内容

为了解决现有技术不能同时从鸡蛋中提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的问题，本发明提供了一种同时提取、净化这几种药物的方法，该方法简单、方便、快速，回收率高。

本发明所采用的技术方案是：一种同时从鸡蛋中提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留的方法，该方法具体是将鸡蛋制成匀浆后，加入氘代氯霉素d₅-CAP内标溶液，然后加入浓度为30％的乙腈溶液混匀，再用体积比49∶49∶2的乙酸乙酯∶乙腈∶氨水提取，再经饱和正己烷脱脂，提取液重复提取一次，最后用氮吹仪吹干。上机前残渣用1.0mL 10％乙腈分两次漩涡振荡溶解，转移至1.5mL离心管中；12100×g离心15分钟，上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液供高效液相串联质谱仪(HPLC-MS/MS)测定。

采用本发明方法能将鸡蛋中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺同时提取出来，且经净化、浓缩步骤得到的浓缩液可以供HPLC-MS/MS检测用。

本发明比较了不同提取剂、提取剂不同体积比对回收率的影响，最终选择碱性乙酸乙酯作为提取剂，且碱性乙酸乙酯(乙酸乙酯∶乙腈∶氨水)体积比为49∶49∶2。因为FFA是弱碱性药物，在pH较高的环境下有较高的溶解性。碱性乙酸乙酯可有效提取四种药物，回收率也较高，且不影响其它三种药物的提取。乙腈可有效去除部分蛋白质，减少内源性杂质，有利于样品净化，在此体积比下，CAP、TAP、FF和FFA的平均回收率能达90.84％以上。本发明采用正己烷(用纯乙腈饱和)去脂，净化效果良好。

最终筛选出了鸡蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺残留的最佳前处理方法。该方法简单、方便、快速，回收率高，平均回收率均在90.84％以上，日内和日间相对标准偏差(RSD)均分别低于5.10％和11.30％，达到或超出欧盟残留测定要求。

具体实施方式

本发明中所涉及的试剂的百分浓度，除特别说明外均指质量百分浓度。

1、实验鸡的饲养、给药和样品采集

随机选取28周龄京海黄鸡产蛋鸡25只，体重1.78±0.22kg，作为空白对照组，单笼饲养。试验前预饲1周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料(自制于江苏京海禽业集团有限公司饲料厂)，自由饮水。连续5d饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，于每天17:30～18:00收集鸡蛋，鸡蛋样品保存在低温蛋库中。

2、本发明提取、萃取、及净化步骤：

(1)用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；

(2)准确称取5.0g鸡蛋匀浆样品，放于50mL具塞离心管中，加入d₅-CAP内标溶液100μL；

(3)加入1mL30％乙腈溶液置漩涡混合器上混匀；

(4)加入10mL乙酸乙酯-乙腈-氨水(49∶49∶2，V/V)，漩涡振荡混匀1min，再用超声波振荡萃取15min；

(5)8000×g离心10min，上清液转移至20mL玻璃管中；

(6)重复步骤4-5提取1次，合并上清液；

(7)在50℃氮吹仪上吹至1～2mL；

(8)加入1.0mL纯乙腈溶解，涡旋振荡混匀1min；

(9)加10mL饱和正己烷(用纯乙腈饱和)脱脂，弃去上层正己烷，下层提取液重复去脂1次；

(10)在50℃氮吹仪吹干；冷冻保存；

上机前用1.0mL 10％乙腈分两次漩涡振荡溶解，转移至1.5mL离心管中；