[发明专利]一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞的分离和提取技术领域，特别是涉及一种采用一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法。 

背景技术

随着心脏疾病研究的不断发展，心脏离体实验已越来越被人们所重视，尤其是具备正常生理功能的单个心肌细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础。目前心肌细胞的提取与培养多采取乳鼠或幼鼠为主，但乳鼠心肌细胞与成熟心肌细胞在功能及结构上都存在不同程度的差异。 

成年大鼠心肌细胞的分离与培养方法也有多种，灌注酶解法用于成年大鼠的心肌分离已有40余年的历史，但至今仍无统一的方法可循。自Powell等于1976年首先成功分离出单个钙耐受成熟心室肌细胞以来，迄今为止国内也仅有少数单位初步建立了可用于原代培养的心肌细胞分离方法。究其原因，是因为心肌细胞分离的每一步都会对最终分离的细胞状态产生重要的影响。实验室温度、Langendorff装置设定温度、心脏摘取速度、水质、溶液的pH值、酶的种类、活力及浓度、细胞内外钙浓度变化、操作者的熟练程度等都会影响心肌细胞状态。 

目前可见的成年大鼠心肌细胞分离与培养方法的报道中，均是采用两种酶混合消化，或者反复的复钙及沉降，这样增加了操作难度和步骤，容易污染，细胞成活率不高。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有分离提取方法不稳定、成活率低、操作步骤复杂的缺陷，提供一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法。 

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案： 

本发明一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法包括如下步骤：

（1）装置预处理：设置Langendorff灌注装置恒温于37℃，消毒，超纯水灌流，预充灌注母液；

（2）灌流：将成年大鼠离体心脏挂于Langendorff灌注装置上，经主动脉逆行灌流，设置灌注流量为6-10ml/min，用含钙液灌流1-2min，然后用无钙EGTA液灌流4-5min，再用Ⅱ型胶原酶液单向灌流1.5-2.5min，之后循环灌流10-18min；灌流含钙液有助于使离体心脏恢复跳动从而排除心腔及心脏冠状动脉系统内的残留血液；灌流无钙EGTA液使心肌细胞处于低钙状态，心脏完全停跳，消减心肌细胞间Ca²⁺依赖的紧密连接，有助于细胞外基质的解离疏散；灌流Ⅱ型胶原酶液用于消化心脏；

（3）消化：剪下心室肌组织，弃去心房和大血管，收集Ⅱ型胶原酶循环液，加入10% BSA溶液至BSA终浓度为8-12mg/ml，取5-10ml，将心室置于其中，37℃、130-160次/min恒温摇床震荡消化5-8min，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，从灌注Ⅱ型胶原酶液开始，每4分钟加入0.1mol/L的CaCl₂溶液45-55μl，共4次；将心室肌组织用含有1%BSA的Ⅱ型胶原酶液在恒温振荡器中振荡消化可使心室解离，从而得到游离的杆状细胞；

（4）沉降：用160目滤网过滤消化液，滤液自然沉降15-20min，收集细胞沉淀，悬浮在30ml酶洗脱液中，再自然沉降15-20min，如此重复洗涤2-3次，所得自然沉降物即为心肌细胞；

（5）前述步骤中所用的试剂为：

灌注母液：NaCl 130 mMol/L、KCl 5.4 mMol/L、HEPES 5 mMol/L、D-Glucose 10 mMol/L、MgCl₂·6H₂O 3.5 mMol/L、NaH₂PO₄ 0.4 mMol/L，用O₂和CO₂体积比为95:5的混合气饱和15min，NaOH调节pH至7.20～7.35；

10%BSA制备：100mg/mlBSA溶解在含80 mMol/L Ca²⁺的灌注母液中，在4℃条件下搅拌混匀，放入含80 mMol/L Ca²⁺的灌注母液中4℃透析1h，换新鲜含80 mMol/L Ca²⁺的灌注母液，在4℃下静置过夜，然后分装，储存在-20℃备用；

含钙液：在灌注母液中加入CaCl₂，使Ca²⁺终浓度为500-750 mMol/L；

无钙EGTA液：在灌注母液加入EGTA，使EGTA终浓度为100 mMol/L；