[发明专利]一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法

权利要求书

1. 一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）装置预处理：设置Langendorff灌注装置恒温于37℃，消毒，超纯水灌流，预充灌注母液；

（2）灌流：将成年大鼠离体心脏挂于Langendorff灌注装置上，经主动脉逆行灌流，设置灌注流量为6-10ml/min，用含钙液灌流1-2min，然后用无钙EGTA液灌流4-5min，再用Ⅱ型胶原酶液单向灌流1.5-2.5min，之后循环灌流10-18min；

（3）消化：剪下心室肌组织，弃去心房和大血管，收集Ⅱ型胶原酶循环液，加入10% BSA溶液至BSA终浓度为8-12mg/ml，取5-10ml，将心室置于其中，37℃、130-160次/min恒温摇床震荡消化5-8min，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，从灌注Ⅱ型胶原酶液开始，每4分钟加入0.1mol/L的CaCl₂溶液45-55μl，共4次；

（4）沉降：用160目滤网过滤消化液，滤液自然沉降15-20min，收集细胞沉淀，悬浮在30ml酶洗脱液中，再自然沉降15-20min，如此重复洗涤2-3次，所得自然沉降物即为心肌细胞；

（5）前述步骤中所用的试剂为：

灌注母液：NaCl 130 mMol/L、KCl 5.4 mMol/L、HEPES 5 mMol/L、D-Glucose 10 mMol/L、MgCl₂·6H₂O 3.5 mMol/L、NaH₂PO₄ 0.4 mMol/L，用O₂和CO₂体积比为95:5的混合气饱和15min，NaOH调节pH至7.20～7.35；

10%BSA制备：100mg/mlBSA溶解在含80 mMol/L Ca²⁺的灌注母液中，在4℃条件下搅拌混匀，放入含80 mMol/L Ca²⁺的灌注母液中4℃透析1h，换新鲜含80 mMol/L Ca²⁺的灌注母液，在4℃下静置过夜，然后分装，储存在-20℃备用；

含钙液：在灌注母液中加入CaCl₂，使Ca²⁺终浓度为500-750 mMol/L；

无钙EGTA液：在灌注母液加入EGTA，使EGTA终浓度为100 mMol/L；

Ⅱ型胶原酶液：取灌注母液加入Ⅱ型胶原酶和CaCl₂，使Ⅱ型胶原酶和Ca²⁺浓度分别为0.02-0.06%（质量）和60-90 mMol/L；

酶洗脱液：灌注母液中加入10%BSA和CaCl₂，使BSA和Ca²⁺终浓度分别为1mg/mL和80-100 mMol/L。

2.按照权利要求1所述一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，其特征在于：灌流步骤为：

将成年大鼠离体心脏挂于Langendorff灌注装置上，经主动脉逆行灌流，设置灌注流量为6ml/min，用含钙液灌流1-2min，然后用无钙EGTA液灌流4-5min，再用Ⅱ型胶原酶液单向灌流2min，之后循环灌流10-18min。

3.按照权利要求1所述一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，其特征在于：消化步骤为：

剪下心室肌组织，弃去心房和大血管，收集Ⅱ型胶原酶循环液，加入10% BSA溶液至BSA终浓度为10mg/ml，取5-10ml，将心室置于其中，37℃、130-160次/min恒温摇床震荡消化5min，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，从灌注Ⅱ型胶原酶液开始，每4分钟加入0.1mol/L的CaCl₂溶液50μl，共4次。

4.按照权利要求1所述一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，其特征在于：沉降步骤为：

用160目滤网过滤消化液，滤液自然沉降15-20min，收集细胞沉淀，悬浮在30ml酶洗脱液中，再自然沉降15-20min，如此重复洗涤2-3次，所得自然沉降物即为心肌细胞。

5.按照权利要求1所述一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，其特征在于：在装置预处理步骤，所述消毒室用75%乙醇灌流10分钟消毒。

6.按照权利要求1或3所述一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，其特征在于：在消化步骤，先将心室由心尖至心底剪开，再放入含有BSA的Ⅱ型胶原酶循环液中。