[发明专利]用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物、探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及探针，及其在基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件中的应用，属于分子生物学领域。 

背景技术

90年代初，市场上第一个转基因食品出现在美国，是一种保鲜番茄。随后十几年，转基因产产品陆续诞生，尤其在食品、医药方面取得很大成绩。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，相继有40多个国家和地区建立和实施了转基因标识制度。随着这些制度的建立与不断完善，人们对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格的要求，各种转基因产品的检测技术也成为了研究热点。 

根据不同转基因产品的检测目的不同，鉴定转基因产品的主要方式有筛查法、基因特异性检测方法、转化体特异性检测方法和构建特异性检测方法。其中转化体特异性检测是特异性最强，应用最多的检测方法。从技术层面讲，在上述检测中应用最多的是PCR技术，包括定性PCR、巢式PCR、复合PCR、竞争性定量PCR和荧光定量PCR等。 

转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫品种。申请人经过对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因玉米MIR162转化体特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的报道。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及探针，及其在基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件中的应用，属于分子生物学领域。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，其序列为： 

MIR162-F：5′-CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3′； 

MIR162-R：5′-GTGACTCCCTTAATTCTC-3′； 

如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。 

所述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物可以用于定性检测玉米及其相关产品是 否含有MIR162转化事件，具体应用时，步骤为： 

(1)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用MIR162-F和MIR162-R引物组合进行PCR扩增； 

(2)PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品中含有MIR162转化事件；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有MIR162转化事件。 

所述步骤(1)中，PCR程序为：95℃5min预变性；94℃30s，50℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。 

所述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物可以用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162转化事件，具体应用时，步骤为： 

(1)建立MIR162转化体特异性引物的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线： 

①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162转化事件的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增； 

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162转化事件的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线； 

(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。 

所述步骤(1)①和(2)中，zSSIIb引物序列(国家标准)如下：