[发明专利]转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的质粒分子，具体来说，涉及一种转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子及其构建方法与应用。

背景技术

在过去的几十年里，随着分子生物学各领域的不断发展，植物基因的分离、基因工程载体的构建、细胞的基因转化、转化细胞的组织培养、植株再生及外源基因表达的检测等各项技术日趋成熟和完善，有关植物基因工程的研究日新月异，许多以前根本不可能的基因转化工作在越来越多的植物上获得成功。各种转基因作物新品种的不断的研究出来。近十几年来，我国农业转基因生物技术得到了飞速的发展，我国转基因抗虫棉花、延熟番茄、抗病辣椒、抗虫杨树和抗病番木瓜，转植酸玉米等已先后获得安全证书，进入了商业化生产。转基因大豆BPS-CV127-9是巴斯夫植物科学公司开发的耐咪唑啉酮类农业除草剂的大豆作物，该品种含有耐除草剂拟南芥AHASL(csr1-2)编码序列和拟南芥AHASL终止子。

随着转基因作物的大量种植及应用，转基因产品开始大量进入我们的生活。转基因产品潜在的食品安全、生态安全问题日益引起人们的关注，各国纷纷制定相应的法律法规对转基因产品进行监管。许多国家以立法或者其他形式要求对转基因产品进行标记。除美国、加拿大、阿根廷和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上的大多数国家如欧盟各国、日本、韩国等国均制定了一系列强制性的标识标准。我国分别于2001年、2002年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，并启动了农业转基因生物的监督监管机制。各国转基因标识制度的相继建立和公众对转基因产品关注度的提高，对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求，因此，各种转基因检测技术也就成了研究热点。

常用的转基因检测方法有聚合酶链式反应(PCR)法，外源蛋白检测法，基因芯片检测技术，分子杂交方法等，目前最主要使用的方法是PCR法。根据不同转基因植物及其检测目的的不同，鉴定转基因植物主要包括检测筛选基因、目的基因、不同基因间的交联结构基因、和转入基因与受体植物间的转化体特异结构基因。转化体特异性检测的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不可能重复的。因此根据不可重复的整合位点特征序列，开发出了转化体特异性检测方法。与前三种方法相比，转化体特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。转化事件特异性检测是转基因作物及其产品检测的发展趋势，必将在转基因检测中发挥重要的作用。

在转基因定性、定量PCR检测过程中，阳性标准品是必须的，因此阳性标准品的配置要求非常严格，必须经过多个实验室的实验验证方可应用于转基因定量PCR检测。以转基因植物的种子等制作的标准物质，制作过程复杂，不易保存，且每个检测都要有相应的标准物质，极大的阻碍了转基因检测的发展。标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效。甚至有学者将质粒标准分子称为“金标准物质”。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了转基因大豆BPS-CV127-9品系的特异性检测用标准质粒分子及其构建方法，使其可以代替转基因大豆BPS-CV127-9的阳性标准物质用于转基因大豆BPS-CV127-9特异性的定性、定量PCR检测。

本发明的设计思路为：根据转基因大豆BPS-CV127-9的品系特异性序列和内标准基因序列，利用重叠PCR反应的原理设计特异PCR引物，经过PCR扩增获得转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异序列和内标准基因lectin一段序列的重组DNA片段。利用分子克隆技术重组DNA片段到克隆载体pGM-T载体中，获得新的质粒分子pGMT-CV127。本发明构建的标准质粒分子可以代替转基因大豆BPS-CV127-9原有的阳性标准物质，用于定性和定量PCR检测，彻底解决了转基因大豆BPS-CV127-9检测中标准物质缺乏的难题。

本发明是通过以下技术方案实现的：