[发明专利]转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子及其构建方法与应用

权利要求书

1.转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子，其特征在于：其空白载体为质粒载体pGM-T，包含有转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异序列和大豆内标准基因lectin的特异性片段。

2.权利要求1所述的转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子的构建方法，其特征在于：首先，设计特异性PCR引物，从转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA中扩增获得转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异序列和大豆内标准基因lectin一段序列的重组DNA片段，然后，利用分子克隆技术重组DNA片段到克隆载体pGM-T载体中，获得新的质粒分子pGMT-CV127。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：步骤如下：

①设计PCR特异性引物；

②特异性的扩增大豆内标准基因lectin和转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列；

③大豆lectin基因和转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列的拼接；

④含有新的重组DNA片段的质粒分子克隆，得到标准质粒分子BPS-CV127-9。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述PCR特异性引物为两对，序列如下：

SOE-CV127-1：GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT；

SOE-CV127-2：GGATGGGGGTGGAGTAGAGGGCAGGGTTTCAGCAGGTTCGTT；

SOE-lec-1：AACGAACCTGCTGAAACCCTGCCCTCTACTCCACCCCCATCC；

SOE-lec-2：GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG。

5.权利要求1所述的转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子在定性检测转基因大豆BPS-CV127-9中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：检测方法为：首先，提取待检测样品的基因组DNA，以此为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，以转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子作为阳性对照；然后，待检测样品的PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物，若存在扩增产物，则待检测样品中含有BPS-CV127-9转化事件；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有BPS-CV127-9转化事件。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述特异性引物序列如下：

CV127-F：5’-GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’；

CV127-R：5’-AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3’；

lectin-F：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3′；

lectin-R：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3′。

8.权利要求1所述的转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子在定量检测转基因大豆BPS-CV127-9中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：检测方法为：首先，以转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子为标准品，使用特异性引物和TaqMan探针进行实时荧光定量PCR扩增，以Ct为纵坐标，以起始拷贝数的自然对数为横坐标，制作大豆内标准基因lectin标准曲线和转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性引物标准曲线；然后，提取待检测样品的基因组DNA，以此为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，将其Ct值代入标准曲线，计算出样品的起始拷贝数，然后利用转基因大豆的拷贝数与大豆内标准基因的拷贝数之比，即可得到样品中转基因大豆BPS-CV127-9的百分含量。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述特异性引物和TaqMan探针的序列如下：

BPS-CV127-9引物和探针序列如下：

CV127-1F：5’-GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’；

CV127-1R：5’-GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3’；

CV127-P：5’-FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’；

lectin基因引物和探针序列如下：

Lectin-1F：5’-GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’；

Lectin-1R：5’-TCCACCCCCATCCACATTT-3’；

Lectin-P：5’-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB-3’。