[发明专利]V5抗原表位融合性酵母表达载体及构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因生物工程领域，具体涉及一种V5抗原表位融合性酵母表达载体及构建方法。

背景技术

酵母是最常用的基因生物工程宿主细胞，这是酵母是单细胞低等真核生物细胞，不仅具有易培养、繁殖、生长条件要求不高等特点外，而且具有遗传背景清楚、基因结构、基因调控、代谢和蛋白质翻译后加工与哺乳动物细胞相似等特点。所以，用酵母细胞表达外源性基因具有良好的发展应用前景。

验证外源性基因在酵母中是否表达，通常是选用外源性基因表达产物的特异性抗体或通过测试外源性基因表达产物的功能来实现。但外源性基因种类很多，许多无特异性商品化抗体，即是有特异性抗体也较昂贵；通过外源性基因表达产物的生物功能进行验证更加复杂，因为对外源性基因表达产物的生物功能有时难以建立方法进行验证，即是建立了方法也较复杂，特别是难验证某些新发现基因在酵母细胞中的表达更加困难。V5抗原是来自副黏液病毒猿猴病毒5的P和V蛋白的抗原表位，多由14个氨基酸(GlyLysProIleProAsnProLeuLeuGlyLeuAspSer Thr)组成。V5抗原表位抗体为一种通用性抗体，目前已经商品化。

发明内容

为了解决目前验证外源性基因在酵母细胞中的表达的困难，本发明提供了一种V5抗原表位融合性酵母表达载体，可以有效地解决外源性在酵母细胞表达的验证问题。

本发明采用的技术方案是：

1)以Invitrogen公司的pYestrp2载体为基本框架，通过PCR方法从酵母基因组扩增酵母强启动子GPD，并经Swa I和BamH I两酶切位点，将其插入到pYestrp2载体中，构建成GPD驱动的酵母表达载体，命名为pGPD；

2)人工合成两条V5抗原表位DNA单链，并分别在各单链的5′端增加BamHI和EcoR I黏性末端(小写所示)。为了能使V5抗原表位DNA能与下游基因相融合，同时在合成时，分别在正链的3′和反链5′端分别增设一个G和C(如下方框所示)，使V5抗原表位DNA通过柔性短肽Gly(甘氨酸)-Ile(异亮氨酸)-即GGA-ATT-与下游基因相融合。

人工合成的V5抗原表位(V5epitope)DNA：

正链为5′-gatccATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACAg-3′；

反链为5′-aattcTGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCCATg-3′；

3)将所合成的V5抗原表位DNA用退火缓冲配成5umol/L，等体积混合，常规退火形双股，将插入到pGPD的相应酶切位点，构建成可与V5抗原表位相融合的酵母表达载体pGPDV5。

附图说明

图1本发明V5抗原表位融合性酵母表达载体示意图。

图2为本发明的技术路线示意图。

图3与V5融合的TR蛋白在酵母细胞中的表达。

图4AR在酵母细胞中的表达。

图5V5抗原表位融合性AR的功能验证原理。其中各泳道为V5融合性TR在不同克隆酵母细胞中的表达。

图6V5抗原表位融合性AR功能验证结果。其中各泳道为V5融合性AR在不同克隆酵母细胞中的表达。

具体实施方式

文中所用到的质粒：

pYESTrp2：购自Invitrogen公司。

pcDNA/TR：购自Clontech公司