[发明专利]哈氏噬纤维菌的电转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种电转化方法，特别是一种哈氏噬纤维菌的电转化方法，属于生物技术领域。

背景技术

哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)是一类好氧的能够彻底降解结晶纤维素的革兰氏阴性细菌，土壤当中广泛存在，属于噬纤维拟杆菌属。由于哈氏噬纤维菌不含有类似厌氧纤维素降解细菌的纤维小体的结构，而且也不分泌游离的纤维素酶，所以其新型的纤维素降解机制到目前为止仍未得到阐明。因其能彻底地降解结晶纤维素，在促进纤维素生物能源转化利用方面具有潜在的应用前景。

鉴于其独特的纤维素降解机理及良好的应用前景，对于其进行分子水平的功能研究就显的极为重要，这对于进一步阐释其纤维素降解机制来说是必要的，而哈氏噬纤维菌的高效转化则是实现基因功能研究的必要手段。

目前，哈氏噬纤维菌的遗传转化经常采用接合转化的方法来完成外源基因的导入，如MARK J.McBRIDE等人通过Tn4351转座的方法得到了突变子，但该方法操作复杂、转化效率低，不稳定且重复性较差，所以寻找新的转化方法是完成哈氏噬纤维菌遗传操作的必要前提。

电转化法由于具有操作简单、转化效率高等优点被广泛应用于多种微生物，但对于哈氏噬纤维菌来说，由于其培养条件特殊、细胞表面结构含有粘多糖等特点，电转化较难完成，在国内外则鲜有报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种哈氏噬纤维菌的电转化方法。该方法通过对哈氏菌的培养条件、生长状态、电击缓冲液、电场强度、质粒浓度、复苏时间等因素进行优化，得到电转化的最优条件并提高了电转化效率。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种哈氏噬纤维菌的电转化方法，步骤如下：

(1)制备外源DNA质粒，获得浓度大于40μg/ml的重组质粒溶液；

(2)配制含有MgCl₂和甘油的水溶液，MgCl₂的终浓度为8mM，甘油体积占溶液总体积的10％，将上述水溶液置于冰浴中，制得电击缓冲液；

(3)将菌种保藏号为ATCC NO.33406的哈氏噬纤维菌菌体在液体培养基TY2中培养活化，170rpm，30℃培养35-50h，再转接TY2液体培养基中培养，170rpm，30℃培养35-50h，然后，离心收集细胞；用预冷的无菌水洗涤重悬细胞，离心；再用步骤(2)制得的电击缓冲液洗涤重悬细胞1-2次，离心；最后用电击缓冲液重悬细胞，制得感受态细胞；

(4)将步骤(3)制得的感受态细胞在14KV/cm、400Ω、25μF的条件下电击4-6ms，然后转入液体培养基TY2，170rpm，30℃复苏培养12-16小时，在含有30μg/ml红霉素的固体平板培养基TY2上筛选转化子，制得电转化后的哈氏噬纤维菌。

所述步骤(1)中的外源DNA质粒为质粒pEP4351。

所述步骤(3)和步骤(4)中的液体培养基TY2，每升组分如下：

蛋白胨：2g，酵母浸出物：0.5g，葡萄糖：2g，纯水定容至1L，pH 7.2；高压蒸汽灭菌。

所述步骤(3)的离心条件为：4℃、7000rpm、5min。

所述步骤(3)的转接量为1％(v/v)；培养时间为40h；最后用100-200倍的电击缓冲液重悬细胞，-70℃冻存。

所述步骤(4)中液体培养基TY2的温度为30℃。提前预冷的液体培养基TY2，可以在一定程度上对受损的细胞加以保护，减少致死率。

所述步骤(4)中固体平板培养基TY2，每升组分如下：

蛋白胨：2g，酵母浸出物：0.5g，葡萄糖：2g，琼脂：10g，纯水定容至1L，pH 7.2；高压蒸汽灭菌。

有益效果

1、本发明通过研究不同影响因素对哈氏噬纤维菌转化效率的影响，优化电转化参数，使外源DNA能利用电转化方法导入哈氏噬纤维菌，最终在筛选平板上可以得到较多转化子菌落，转化效率达到5×10⁴/μg DNA。

2、本发明在电击缓冲液中添加MgCl₂，通过去除哈氏噬纤维菌细胞表面的粘多糖成分，使外源DNA更容易进入哈氏噬纤维菌，从而提高转化效率2-3倍。

3、本发明通过降低加入筛选培养基的温度，对受损的细胞加以保护，减少致死率。

4、本发明可以弥补目前使用的接合转化方法的不足，为哈氏噬纤维菌的遗传操作系统及分子生物学研究提供一种了方便、快速的途径。

附图说明