[发明专利]多氧霉素与尼可霉素杂合抗生素及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用合成生物学策略对多氧霉素工业菌株进行代谢通路改造而生产杂合抗生素，具体而言，涉及多氧霉素与尼可霉素杂合抗生素及其制备方法，属于生物制药领域。

背景技术

近年来，一方面由于广谱抗生素、免疫抑制剂、细胞毒药物的广泛应用，导管介入、器官移植等治疗手段的普及以及恶性肿瘤、艾滋病等临床严重疾病的发生率不断上升，深部真菌感染病例日益增多；另一方面，临床抗真菌药物的长期运用，真菌耐药性也越来越严重。因此目前亟待需要研发出新型的抗真菌药物来应对日益严重的深部真菌感染问题。

作为几丁质合成酶的特异性抑制剂，多氧霉素与尼可霉素不仅具有广谱的抗真菌活性，并且对动植物毒性较低。但由于体外活性很难转化为体内活性，这两个抗生素并没有在临床上得到广泛应用。

如下结构式所示，多氧霉素与尼可霉素在化学结构上具有很大的相似性。它们都是由一个核苷骨架与一个或两个肽基组合而成。多氧霉素是尿嘧啶或其5’位置被甲基、羟甲基或羧基取代的尿嘧啶，而尼可霉素核苷骨架的碱基部分也可以是尿嘧啶，因而两者都可以使用尿嘧啶作为核苷骨架的碱基部分。

多氧霉素与尼可霉素结构上也有很多不同点。就核苷骨架的碱基部分来说，尼可霉素除了可以使用尿嘧啶外还可以使用4-甲酰-4-咪唑-2-酮。对肽基部分来说，两者结构上的不同点更为明显。多氧霉素在R1位置的肽基可以是聚肟酸(POIA)，而尼可霉素在该位置可以是谷氨酸；多氧霉素的另一个肽基是氨甲酰多氧聚草氨酸(CPOAA)，尼可霉素的另一个肽基是羟基吡啶同型苏氨酸(HPHT)。

由于尼可霉素与多氧霉素有相同的核苷骨架，因而它们的负责核苷骨架生物合成的蛋白有较高的同源性。与核苷骨架生物合成相关的蛋白包括PolA、PolD、PolH、PolI、PolJ、Polk都在尼可霉素生物合成酶系中有同源性较高的蛋白。此外，负责多氧霉素核苷骨架与肽基的组装的PolG、负责多氧霉素运输的PolQ1和PolQ2、负责多氧霉素生物合成调控的PolR也都有同源的尼可霉素生物合成蛋白相对应。

多氧霉素与尼可霉素化学结构上有一定的相似性，但有所不同；而且两者的生物合成基因簇中相关基因同源性也较高。这也就意味着一方面可以基于两个抗生素结构上的不同点设计一系列杂合抗生素，另一方面由于化学结构相近，基因同源性较高，因而生物合成蛋白对于底物的选择也可能有一定的宽容性。因而可以通过对多氧霉素与尼可霉素的生物合成基因簇进行改造而产生杂合抗生素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供多氧霉素与尼可霉素的四个杂合抗生素Polyoxin N、Nikkoxin B、Nikkoxin C、Nikkoxin D，其结构式如下所示。

制备上述杂合抗生素的方法，包括以下步骤：

1)重组菌株ZLP2、ZLP3和ZLP6的构建

将质粒pJTU5701/ΔnikB通过接合转移入多氧霉素工业菌株polA基因突变株SA1，通过apramycin抗性筛选，得到重组菌株ZLP2；

将质粒pJTU5701/ΔnikB通过接合转移入多氧霉素工业菌株polA和polF基因双突变株SA2，通过apramycin抗性筛选，得到重组菌株ZLP3；

将质粒pJTU5701/ΔnikBΔnikQ通过接合转移入多氧霉素工业菌株polA和polF基因双突变株SA2，通过apramycin抗性筛选，得到重组菌株ZLP6；

2)重组菌株ZLP2、ZLP3和ZLP6的发酵及杂合抗生素提取和纯化

将重组菌株ZLP2、ZLP3或ZLP6直接进行发酵培养，发酵液用草酸调节pH值至3.0，过滤后用强酸性阳离子交换树脂吸附，用氨水洗脱，选择性收集组分，旋转蒸发浓缩；用HPLC进行检测，再经制备型HPLC得到杂合抗生素纯品。