[发明专利]一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的生物催化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及生物催化制备D-氨基酸的新工艺。特别是利用粪产碱杆菌细胞催化DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的生物催化方法。

背景技术

在自然界中，D-氨基酸是稀有的非蛋白源氨基酸，其数量约占已发现的300多种氨基酸的10%左右。随着医学和生物学的发展，发现D-氨基酸与某些疾病如白内障、早年痴呆、肾脏病等密切相关。此外， D-氨基酸已越来越多地作为手性中间体用于手性药物、手性农药以及手性食品添加剂的合成，在医药、农药和食品领域有广泛应用。

D-氨基酸的制备方法主要包括化学法和生物法。

化学法主要包括化学拆分法和化学不对称合成法。化学拆分法工艺路线复杂，拆分收率低。化学不对称合成采用价格昂贵的手性源、手性助剂或手性催化剂，得到的D-氨基酸光学纯度不高。

生物法包括生物拆分法、生物不对称合成法和生物去消旋化法。生物法具有过程简单、转化效率高、副产物少、分离纯化工艺简单等优点，已成为D-氨基酸的主流生产技术。生物拆分法以酰化酶、脂肪酶等酶为生物催化剂对衍生的DL-氨基酸进行拆分，D-氨基酸的理论收率为50%，涉及衍生、去衍生等步骤，工艺普适性差。生物不对称合成法如转氨酶法以D-转氨酶为生物催化剂，价格高昂的酮酸为原料、另一个D-氨基酸为氨供体，分离工艺相当复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种光学纯度高、分离工艺简单的D-氨基酸制备方法。

为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的方法，以一种DL-氨基酸为原料，通过以下步骤获得所述DL-氨基酸中的D-对映体：

a）细胞培养：将粪产碱杆菌接种到培养基中，采用所述DL-氨基酸中的L-对映体作为诱导剂加入培养基中，30℃下培养24h，离心，获得湿菌体；

b）细胞通透性处理：采用丙酮对步骤a）所获得的湿菌体处理5～20min，离心，用生理盐水洗涤，获得通透性细胞；

c）酶催化反应：将步骤b）所获得的通透性细胞加入蒸馏水中，使其悬浮，加入所述原料，30℃下反应24～72h，使原料DL-氨基酸中的L-对映体氧化脱氨形成酮酸；

d）D-氨基酸分离：将步骤c）的反应液离心以去除细胞，所获得的离心液加入盐酸酸化至pH2～3，浓缩至干，得D-氨基酸盐酸盐；将所述D-氨基酸盐酸盐溶于乙醇中，过滤，向滤液中加入环氧丙烷以脱除盐酸，获得D-氨基酸。

生产工艺路线是：

本发明以产L-氨基酸氧化酶的粪产碱杆菌整细胞为生物催化剂，催化DL-氨基酸中的L-对映体氧化脱氨形成相应的酮酸。粪产碱杆菌菌株来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，选自Alcaligens faecali 1.767、1.924、1.1799、1.7686、1.2006、1.1837，优选Alcaligens faecali 1.1799。反应过程中产生的过氧化氢可以分解为水和氧，氨气可以排放，以实现对映纯D-氨基酸的高效制备。

与现有的D-氨基酸制备技术相比，本发明提出的方法具有以下优点：1）工艺简单。与化学拆分和生物拆分不同，DL-氨基酸不经衍生，直接作为反应底物。产物D-氨基酸和酮酸容易分离； 2）方法的通用性好，不仅适用于非天然D-脂肪氨基酸的制备，也适用于非天然D-芳香氨基酸制备，获得的D-氨基酸化学纯度和光学纯度高；3）反应条件温和，不需要高温高压和有机溶剂，环境友好。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，作出各种替换和变更，均应包括在本发明范围内。

一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的方法，以一种DL-氨基酸为原料，通过以下步骤获得所述DL-氨基酸中的D-对映体：

a）细胞培养：将粪产碱杆菌接种到培养基中，采用所述DL-氨基酸中的L-对映体作为诱导剂加入培养基中，30℃下培养24h，离心，获得湿菌体；

b）细胞通透性处理：采用丙酮对步骤a）所获得的湿菌体处理5～20min，离心，用生理盐水洗涤，获得通透性细胞；

c）酶催化反应：将步骤b）所获得的通透性细胞加入蒸馏水中，使其悬浮，加入所述原料，30℃下反应24～72h，使原料DL-氨基酸中的L-对映体氧化脱氨形成酮酸；