[发明专利]一种氯代烃高效好氧降解混合菌剂的制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及采用生物法治理地下水污染领域技术，更具体地讲，涉及一种氯代烃高效好氧降解混合菌剂的制备方法与应用。

背景技术

随着人类活动的加剧，地下水的污染日益严重。据我国有关部门对118个城市连续2～7年的监测统计，约有64%和33%的城市地下水遭受了重度和轻度的污染，其中有机物污染问题已经相当突出。尤其是氯代烃，在尖端工业中被大量用作清洁剂，由于人们越来越关注由这些物质或含这些物质的废水引起的地下水污染，所以有必要立即采取措施对付这种污染。

目前地下水污染治理与修复的方法主要有：物理法、化学法、生物法。物理法主要是指抽出处理法，是地下水修复的代表性技术，应用最为广泛。化学氧化法也常用于石油烃污染及氯代烃污染的地下水修复，但是成本较高。生物法包括微生物降解和植物修复，在土壤中接种高效的菌种可以显著提高降解效果；实践研究表明生物法处理石油烃污染、多环芳烃污染和氯代烃污染能达到较高的去除效率，并与上述物理、化学方法相比，生物法处理无需大量的能量，成本较低，同时，它们也能够完全降解污染物和使之脱毒而不会引起二次污染。 而且即使污染物处于低浓度也可以进行降解，可以完全意义上的实现降低污染，且降低治理费用。

采用微生物净化土壤的方法包括异位修复和原位修复，其中异位修复法主要包括固相处理法及泥浆处理法，固相处理法是将微生物与磷、氮等营养源混入翻挖的土壤中促进污染物的降解；泥浆处理法是将微生物与水和营养源混入翻挖的土壤中，以流体形式处理土壤，促进污染物的降解；原位处理法，是将空气、营养源等注入污染土壤中，无需翻挖来促进土壤中存在的微生物降解污染物。

在上述生物处理法中，异位处理法由于需要翻挖土壤，应用范围受到限制，处理和设备费用相对较高。原位处理法费用低，操作便捷，但由于土壤中微生物含量较少，尤其是氯代烃降解微生物，土壤中可能并不存在。在这种情况之下，通过实验筛选培养获得能够降解氯代烃的微生物并将它们接种至土壤中，使得净化速率提高。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，从受三氯乙烯（TCE）污染场地土壤中，驯化、筛选出可耐受并对TCE具有一定降解能力的微生物菌株，然后将菌株制成菌剂。

本发明的第二个目的在于，提供一种氯代烃好氧降解混合菌剂。

本发明的第三个目的在于，提供一种氯代烃好氧降解混合菌剂在净化含氯代烃的水或土壤中的应用。

为实现第一个目的，本发明采取了以下技术方案：

一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，包括驯化、分离和鉴定，包括以下步骤：

（1） 取999.0mL基础培养基、1.0mL微量元素，摇匀后作为液体无机盐培养基备用；取50mL所述液体无机盐培养基，在温度为121℃的高压锅内灭菌20分钟，在超净台中冷却，再加入2 g受TCE污染的土壤，30 ℃，转速180 r/min条件下，避光、恒温振荡，培养36 h，获得培养菌液；

（2） 取步骤（1）中获得的培养菌液5 mL, 转接到装有10 mg/L TCE和0.15 g/L葡萄糖的上述新鲜液体无机盐培养基中，驯化培养直至溶液浑浊得到驯化培养基； 

（3） 配置分离培养基，调pH至7.0，用去离子水定容至1000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌后，在超净台中冷却至38~40℃，在超净工作台中取步骤（2）获得的驯化培养基1 mL，按10倍稀释法将菌液稀释成10^-1-10^-7梯度的菌悬液，取0.1 mL涂布于上述分离培养基上，用无菌涂布器涂布均匀，将培养皿置于30 ℃的生化培养箱中培养观察，48h后便可发现有明显菌落出现，挑选菌落，将其接种至上述分离培养基中，在温度30℃、转速180 r/min的振荡器中培养48 h得到菌液；

（4）以所得菌液作为接种物，添加到含有TCE 50 mg/L的基础培养基中，菌液和基础培养基的体积比为1:10，培养温度为30 ℃，培养时间为36~48 h，经离心得到菌液，按体积比500：1加入酵母提取物和麦麸的保护剂，然后利用真空冷冻干燥机制备成固体氯代烃好氧降解混合菌剂。

作为一个优选，在步骤（3）之后、步骤（4）之前还包括步骤（3A），所述步骤（3A）为：将步骤（2）至步骤（3）作为一个分离纯化周期，重复步骤（2）至步骤（3），但每次用前一个分离纯化周期中步骤（3）获得的菌液代替步骤（2）中初始用到的培养菌液，分离纯化6个周期以上得到菌液。