[发明专利]一种氯代烃高效好氧降解混合菌剂的制备方法与应用

权利要求书

1.一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，包括驯化、分离和鉴定，其特征在于，包括以下步骤：

（1） 取999.0mL基础培养基、1.0mL微量元素，摇匀后作为液体无机盐培养基备用；取50mL所述液体无机盐培养基，在温度为121℃的高压锅内灭菌20分钟，在超净台中冷却，再加入2 g受TCE污染的土壤，30 ℃，转速180 r/min条件下，避光、恒温振荡，培养36 h，获得培养菌液； 

（2） 取步骤（1）中获得的培养菌液5 mL, 转接到装有10 mg/L TCE和0.15 g/L葡萄糖的上述新鲜液体无机盐培养基中，驯化培养直至溶液浑浊得到驯化培养基； 

（3） 配置分离培养基，调pH至7.0，用去离子水定容至1000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌后，在超净台中冷却至38~40℃，在超净工作台中取步骤（2）获得的驯化培养基1 mL，按10倍稀释法将菌液稀释成10^-1-10^-7梯度的菌悬液，取0.1 mL涂布于上述分离培养基上，用无菌涂布器涂布均匀，将培养皿置于30 ℃的生化培养箱中培养观察，48h后便可发现有明显菌落出现，挑选菌落，将其接种至上述分离培养基中，在温度30℃、转速180 r/min的振荡器中培养48 h得到菌液；

（4）以所得菌液作为接种物，添加到含有TCE 50 mg/L的基础培养基中，菌液和基础培养基的体积比为1:10，培养温度为30 ℃，培养时间为36~48 h，经离心得到菌液，按体积比500：1加入酵母提取物和麦麸的保护剂，然后利用真空冷冻干燥机制备成固体氯代烃好氧降解混合菌剂。

2.根据权利要求1所述的一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤（3）之后、步骤（4）之前还包括步骤（3A），所述步骤（3A）为：将步骤（2）至步骤（3）作为一个分离纯化周期，重复步骤（2）至步骤（3），但每次用前一个分离纯化周期中步骤（3）获得的菌液代替步骤（2）中初始用到的培养菌液，分离纯化6个周期以上得到菌液。

3.根据权利要求1所述的一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述基础培养基的组成为：Na₂HPO₄ ：4.26g.L^-1，KH₂PO₄ ：2.65 g.L^-1，NH₄Cl：0.5 g.L^-1，FeCl₂·4H₂O ：0.01 g.L^-1，CaCl₂ ：0.02 g.L^-1，MgSO₄·7H₂O ：0.2 g.L^-1；所述微量元素的组成为：HBO₃：0.3 g.L^-1，ZnCl₂：0.07g.L^-1，NaMoO₄·2H₂O：0.024g.L^-1，MnCl₂·4H₂O：0.006g.L^-1，NiCl₂·6H₂O：0.75 g.L^-1，CoCl₂·6H₂O：0.19 g.L^-1。

4.根据权利要求1所述的一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的驯化培养，一般以3 d作为一个驯化周期，一个驯化周期后，取5 mL驯化后的菌液转接至设定TCE浓度的新鲜液体培养液中，驯化过程中的TCE的浓度为10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种氯代烃好氧降解混合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中分离培养基的配制方法为，NaCl 5g,，牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，用5 mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1000mL，121 ℃高压蒸汽灭菌后，在超净台中冷却至38—40℃获得。