[发明专利]基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物基因检测方法，尤其涉及一种基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法，适用于微生物定性检测。

背景技术

微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物和显微藻类等在内的一大类生物群体。微生物个体微小，却与人类生活关系密切，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业和环保等诸多领域。微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行，在人类疾病中有50％是由病毒引起。食品污染严重威胁人类身体健康，食源性致病菌是引起细菌性食物中毒的病原体。因此，微生物检测在人类社会生活中具有极其重要的意义，开发一种快速灵敏的微生物基因检测方法十分必要。

传统检测微生物的培养方法，需要分离、筛选和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般为4～6d，费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性和耗时费力等缺点。

各种常规PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应)方法具有敏感性强、特异性高、简便和快速等优点，有较多应用于微生物基因检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。

近年来发展起来的LAMP(loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增技术)以其灵敏度高、速度快和特异性强等优点在基因定性检测方面得到广泛应用，并且已经成为当前核酸定性检测的重要方法之一。

LAMP是一种新型的等温核酸扩增方法，该方法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件(65℃左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物——白色焦磷酸镁沉淀。该方法具有不需要PCR仪、肉眼可判断结果及反应时间短、特异性强和灵敏度高等优点。

因此焏待开发一种精确、灵敏、快速和无污染的临床检验方法。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，并针对LAMP出现的白色焦磷酸镁沉淀肉眼难以辨别问题做出改进，提供一种基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法(简称检测方法)。

本发明的目的是这样实现的：

基本思路：

本检测方法先按照国标法用缓冲蛋白胨水增菌培养待检样品，然后利用水煮法提取样品DNA，接着将提取到的样品DNA进行恒温扩增，最后通过荧光显色法用肉眼直接判断检测结果。

具体地说，本检测方法包括下列步骤：

①用缓冲蛋白胨水(Buffer Peptone Water简称BPW)按照国标法培养待检样品4h；

②用水煮法从待测样品中提取DNA；

③将DNA加入到LAMP反应体系中，65℃保温1h；

④通过与对照组比较，肉眼观察待测样品结果，对样品进行定性分析；

所述LAMP反应体系包括LAMP反应液和荧光显色剂；

a)LAMP反应液

LAMP反应液由LAMP 10×buffer 2.5μl，20μmol/L内引物FIP、BIP各2.0μl，20μmol/L外引物F3、B3各1.0μl，25mmol/L dNTPs 3.0μl，50mmol/L MgSO₄3.0μl，1.0mol/L甜菜碱5μl，Bst DNA聚合酶大片段1.0μl，无菌双蒸水2.0μl组成，反应液总体积22.5μl；

b)荧光显色剂

荧光显色剂是由10μmol/L-20mmol/L的钙黄绿素1μl和60μmol/L-0.1mol/LMnCl₂ 0.5μl组成。

本发明的工作原理：

在本发明提供的LAMP反应体系中含有荧光显色剂(钙黄绿素和MnCl₂)，在等温扩增反应之初，钙黄绿素与荧光淬灭剂MnCl₂结合而不发荧光。由于反应生成的焦磷酸根离子更容易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素，游离的钙黄绿素就可以自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。因此，当使用本发明检测样品时，在恒温条件(65℃左右)保温约1h后，在日光灯下阳性样本管呈绿色，阴性样本管呈橙色，在紫外灯下，阳性样本管显示强荧光，阴性样本管则不显示荧光。