[发明专利]人乳头瘤病毒型别杂合病毒样颗粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及由不同型别HPV L1蛋白杂合组装形成的人乳头瘤病毒型别杂合病毒样颗粒及其制备方法，所述型别杂合病毒样颗粒可用于预防两种或两种以上HPV感染及由HPV感染所导致的疾病。本发明还涉及上述型别杂合病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染及由HPV感染所导致的疾病如宫颈癌、尖锐湿疣等。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)主要引起皮肤，粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的肛生殖器癌症主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感染的最有效方式是HPV疫苗，特别是能引起宫颈癌的高危型HPV疫苗。

HPV的主要衣壳蛋白L1具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus-Like Particle，VLP)的特性。HPV VLP是由72个主要衣壳蛋白L1的五聚体以二硫键连接而构成20面体立体对称结构(Doorbar，J.and P.H.Gallimore.1987.J Virol，61(9)：2793-9)。HPV VLP结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992Proc Natl Acad Sci U S A 89(24)：12180-4)。结构研究和突变分析表明，HPV16 L1蛋白Cys175、Cys185和Cys428对VLP的基本结构单位五聚体之间的相互作用起关键的作用，Cys161、Cys229、Cys379对于单体分子间的相互作用是必需的，提示发生在L1蛋白分子内和/或分子间的二硫键对于HPV病毒样颗粒的组装有重要的作用(Ishii Y.，Tanaka K.，Kanda T.2003 Virology.308：128-136)。本研究即对这些二硫键进行改造，发明新的人工HPV型别杂合病毒样颗粒。

现有的研究发现，HPV VLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，仅在一些同源性高的型别之间存在交叉保护。因此，现有的HPV疫苗的保护范围有限。如果要扩大HPV疫苗的保护范围只能通过增加疫苗中所含有的HPV VLP型别来实现。这将大大提高HPV疫苗的生产成本，并可能因为免疫剂量增加而带来潜在的安全性问题。而目前已上市的HPV疫苗(包括：Merck公司的HPV16，18，6，11四价疫苗和GSK公司的HPV16，18二价疫苗)均采用单独型别VLP混合制备而成的。因此，本领域仍然需要能够诱导针对多型别HPV保护性抗体的HPV L1病毒样颗粒，从而使制备预防更多型别HPV的宫颈癌疫苗成为可能。

发明内容

本发明至少部分基于发明人的以下的出人意料的发现：利用大肠杆菌表达系统表达两个或两个以上不同型别的175位与428位半胱氨酸突变或缺失的HPV L1蛋白，所述突变或缺失的HPV L1蛋白单独不能形成病毒样颗粒，然而，按照一定的混合方式及一定的浓度比例混合后去除还原剂，可得到一种新的杂合VLP。该杂合VLP含有两种或两种以上的HPV L1蛋白，可诱导针对两种或两种以上HPV的高滴度中和抗体。

因此，在一方面，本发明涉及组装成杂合病毒样颗粒的突变或缺失的HPV L1蛋白，所述蛋白包括但不限于：HPV L1-C175A、HPV L1-ΔC428、HPV L1-ΔC175、HPV L1-C175S、HPV L1-C428A、HPV L1-C428S等。

在一个优选的实施方案中，HPV L1-C175A与HPV L1-ΔC428按照1∶1的摩尔比混合。在其它实施方式中，二者的比例包括2∶1、1∶2等等。

在另一个方面，本发明涉及一种制备本发明的杂合病毒样颗粒的方法。在一个优选实施方案中，制备本发明的杂合病毒样颗粒的方法包括：

a)在大肠杆菌中表达所述突变或缺失HPV L1蛋白，

b)将表达所述突变或缺失HPV L1蛋白纯化，得到纯度95％以上的突变或缺失HPV L1蛋白，

c)将b)纯化的突变或缺失L1蛋白：HPV L1-C175A与HPV L1-ΔC428按照1∶1的摩尔比混合，透析去除还原剂，即得到杂合VLP。