[发明专利]仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗的生产方法，属于生物技术领域，特别是属于兽用生物制品行业。 

背景技术

仔猪水肿病是严重阻碍着养猪业发展的常见疾病之一，其发病急，死亡快，死亡率极高，发病后往往来不及治疗就死亡，常造成养殖业主较大经济损失。经过几十年的深入研究，人们对水肿病的发病机理有了比较详细的了解，明确了仔猪水肿病的发生与产类志贺氏毒素II型变异体(stx2e毒素)的大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的两个致病因子-F18ab菌毛和stx2e毒素密切相关(Imberechts H，De Greve，Schlicker C，et al.Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli st rain F107/86[J].Microb Pat hog Sep，1996，21(3)：183-192.)。F18ab菌毛为黏附因子，可黏附于小肠绒毛膜上从而使细菌得以定居，并大量分泌stx2e毒素，该毒素是仔猪水肿病的直接致病因子，该病的临床症状和病理变化均由其引发。stx2e毒素是一种蛋白外毒素，不但具有很高致病性，也具有很强的免疫原性，用其制备灭活疫苗可以有效预防仔猪水肿病的发生(Wieler L H，Franke S，Menge C，et al.Investigations on the immunoresponse during edema disease of piglet s after weaning by using a recombinant B subunit of shiga2like toxin II e.Dtsch Tierarztl Wochenschr，1995，102：40-43.)。 

stx2e毒素是一种高致病性毒素，临床分离株往往只需分泌少量的毒素就足以对仔猪致病，甚至致死，因此临床分离株在人工培养条件下往往很难大量培养出该毒素。我们对原用于产志贺氏菌菌素的培养基进行改进，对培养基的组份和成分含量进行优化，大大提高了培养基产stx2e毒素的产量和产毒效率，所生产的stx2e毒素毒性高，灭活后免疫原性强，这为制备高效的预防仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位疫苗奠定了坚实的基础。 

在此基础上，我们进行了仔猪水肿病毒素亚单位疫苗的研制工作。研制结果表明，我们研制的亚单位疫苗使用剂量小，免疫效力高，安全性好，对仔猪的生长没有任何不良影响，为防治仔猪水肿病奠定了坚实的基础。 

发明内容

一、生产用菌株 

1.菌株来源 

制造和检验用仔猪水肿病的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株由本申请人分离、鉴定、保存和供应，该菌株已于2011年11月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5484。 

2.菌株特点 

(1)形态和生化特性本菌株为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，大小为0.4～0.7um×2～3um；能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖，产酸产气，IMViC试验(吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验)反应为-、+、-、-。 

(2)培养特性菌种在SB固体培养基上，36～37℃培养20小时，菌落光滑、圆整、湿润，直径1～2mm。在SB液体培养基中，36～37℃培养20小时，呈均匀一致混浊。 

(3)血清学特性用O抗原定型血清进行血清型鉴定，应为O139。 

(4)stx2e毒素毒力鉴定以本菌所提取的stx2e毒素，静脉注射25～40日龄仔猪，0.03mg/头，或腹腔注射体重20g左右昆明小鼠，0.01mg/只，可使所有试验仔猪或小鼠发生以后肢瘫痪、共济失调为特征的神经症状，甚至死亡。 

二、stx2e毒素亚单位疫苗的制备方法： 

1 生产用种子制备将大肠埃希氏菌EDQD株(由青岛易邦生物工程有限公司分离、鉴定、保存)冻干的菌种接种改良SB液体培养基(见附件1)，接种固体琼脂平板，挑取典型菌落若干，经PCR鉴定毒素基因合格后(见附件3)，即可用于接种。 

2 菌液培养采用发酵培养法对大肠埃希氏菌EDQD株进行培养，发酵培养基为改良SB培养基。