[发明专利]气相色谱－质谱检测尿有机酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生化检测技术领域，具体涉及新鲜尿、冷冻尿和尿滤纸片通过气相色谱-质谱检测尿有机酸的方法。 

背景技术

由于尿中含有的氨基酸，糖类，脂质和其它代谢终末或中间产物，而这些代谢产物的定量水平反应身体本身的代谢情况。通过测定相关代谢物的种类和量值，可以参考判断遗传性代谢疾病，对我国的新生儿遗传代谢病确症，及时干预，治疗及发病机制都有着重要的作用。 

北美或日本学者曾采用溶剂萃取方法来处理尿样，处理后用气相色谱-质谱分析法进行检测。现有的前处理方法是采用乙酸乙酯或者正己烷对尿样进行萃取，由于溶剂选择性会丢失氨基酸和糖类等易溶于水的化合物。而且萃取操作和过后的干燥过滤操作繁琐，且多次萃取操作易导致灵敏度下降，容易因操作人员的不同导致差异，结果难测，并且整个操作耗时2-3小时。可见，这样的前处理使得一些水溶性的糖类和氨基酸由于溶解度的差异造成丢失，而且同时部分有机酸也出现含量降低。这种结果对于疾病的判断和代谢疾病的发病机制推理都不能给出完整信息。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术之不足，提供一种快速准确的气相色谱-质谱检测尿有机酸的方法。 

为此，本发明采用的技术方案是这样的：气相色谱-质谱检测尿有机酸的方法，包括如下步骤：1，对待检尿液样本完成尿酶处理；2，加入内标品，采用冷 冻乙醇进行沉淀蛋白的处理，将样本吹干；3，对上述样本进行甲基硅烷化衍生处理；4，采用上述1-3的步骤处理标准有机酸，得到标准有机酸样本；5，采用气相色谱-质谱联用仪对标准有机酸样本和待检尿液样本进行检测；6，以标准有机酸样本的检测结果作为参比曲线，用常规算法对待检尿液样本的有机酸进行定量。 

进一步地，步骤5中的检测流程是这样的：采用分离模式进样，色谱柱：DB-5ms，进样口温度：250℃，柱温箱初温：100℃，保持4分钟，以4℃/min速率升温至250℃保持16分钟；He气流速：1.1ml/min；溶剂延迟：5分钟；离子源模式：+El；离子源温度：200℃；四极杆温度：150℃；调谐模式：自动调谐Autotune；质荷比范围30m/z到600m/z，扫描周期0.4s，样本分析时间60min；计算机系统记录色谱和质谱图形，应用之前各有机酸标准品建立的客户定性谱库做定性匹配，并采用已有参比鉴定的定量曲线校正方法进行定量。 

作为技术方案的比较选择，发明人还尝试过这样的检测流程：柱温箱初温：70℃，保持4分钟，以10℃/min速率升温至250℃保持8分钟。He气流速：1.3ml/min溶剂延迟：3分钟，离子源模式：+El离子源温度：200℃，四极杆温度：150℃调谐模式：自动调谐Auto tune质荷比范围30m/z到600m/z，扫描周期2s，样本分析时间30min。实践证明，这个程序的分离效果比较差，多个有机酸未能分开，而且由于扫描周期的延长会使峰形由于缺失数据点而失真，定量造成困难。 

步骤2中所述的内标品含有十七烷酸(MGA)，托品酸(IS-2)，二十四烷酸(C24)，重量比例如下：十七烷酸(MGA)35～45％；托品酸(IS-2)15～25％；二十四烷酸(C24)35～40％，混合为浓度为1.2-1.8mg/ml的水溶液。 

步骤4中的标准有机酸包括甲基琥珀酸，尿嘧啶，3-甲基戊二酸，5-氧合 脯氨酸，2-羟基马尿酸，2-羟基异己酸，癸二酸，马尿酸，其浓度均为0.6-1.0mg/ml。 

更进一步地，检测结束后用质控品重复步骤1、2、3、5，从而校正标准有机酸的参比曲线，所述的质控品中包括如下重量比的成分：甲基琥珀酸10～20％，尿嘧啶8～12％，3-甲基戊二酸10～20％，5-氧合脯氨酸15～25％，2-羟基马尿酸10～20，2-羟基异己酸5～10％，癸二酸5～10％，马尿酸8～12％；将各标准品混合后制成冻干粉而得，使用时复溶为浓度为0.7-1.0mg/ml的水溶液。