[发明专利]一种前T载体、T载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域一种质粒载体及其构建方法，特别涉及一种T载体及其制备方法。

背景技术

克隆(Clone)是指一个共同前体通过无性繁殖而形成的一群基因结构相同的细胞或个体。对于基因克隆，则指一个基因反复扩增后产生的多个拷贝。亚克隆(Subclone)是指用限制性酶切或PCR等手段从已经克隆的DNA中获得该克隆DNA的部分序列或改造过的序列，再克隆到另外的新载体中的技术。PCR(Polymerase Chain Reaction)，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，实验室应用最为广泛常用的Taq DNA聚合酶不仅具有5′-3′延伸引物的聚合酶活性，还具有非模板依赖型末端转移酶活性，用该酶进行PCR反应后，所产生的片段3′末端大部分突出一个A碱基，将突出末端A碱基消除进行平端连接不仅效率极低而且较为繁琐。

T-A克隆是把PCR片断与一个具有3′-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3′加上A，例如，Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3′端自动添加一个3′-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3′-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。T载体(T-Vector)就是其3′末端带有突出的T碱基，是可直接与PCR扩增产物3′末端突的A碱基配对的线性载体。

现在市场上主流的制备T载体的方案一般有以下几种：一种先利用平端内切酶将环状质粒酶切成平末端的线性载体，再利用核酸末端转移酶，以dTTP为底物在两个3′末端各加上一个T(Holton，T.A.and Graham，M.W.A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors(一种利用ddT突出端载体直接克隆PCR产物的简便有效的方法).Nucleic Acids Res.1991，19，1156)。另一种方法是：先制备一种前T载体，再利用特殊的XamI限制性内切酶酶切，得到3′末端含有一个T的线性载体。

第一种方法在制备T载体的过程中存在加尾效率较低以及线性质粒在加尾过程中两端的序列有时会被部分删除等问题。第二种方法中因为氨苄青霉素易被宿主菌表达出来的β-内酰胺酶降解，形成卫星菌落，不利于平板菌的保存和放置。

有鉴于此，制备一种为下游克隆提供高效保证的T载体，成为一项至关重要的研究课题。

发明内容

针对现有技术中T载体制备过程中存在加尾效率较低，平板菌不易保存等问题，本发明提供了一种前T载体、T载体及其制备方法。

根据本发明，提供了一种前T载体、T载体及其制备方法。其中，前T载体具有序列表中序列13的核苷酸序列，采用Eaml105I限制性内切酶酶切该前T载体，得到pUC57卡那霉素抗性T载体，前T载体的制备方法包括以下步骤：

1)设计酶切位点将pUC57载体上的氨苄青霉素基因剪切下来，并以此为模板设计三对引物：KAN-F与KAN-R，AlwNI-F与AlwNI-Kan-R及Kan-AatII-F与AatII-R，三对引物具有序列表中序列1～6中的核苷酸序列；

2)将pET28-a的卡那霉素基因扩增下来，将卡那霉素基因与上游酶切位点间的序列及卡那霉素基因与下游酶切位点间的序列扩增下来，分别得到片段KAN、片段AlwNI-Kan及片段Kan-AatII，三个片段分别具有序列表中序列7～9的核苷酸序列，利用overlapping技术连接片段KAN、片段AlwNI-Kan、片段Kan-AatII，将得到的PCR产物进行双酶切；

3)将氨苄青霉素pUC57进行双酶切，得到的酶切产物与步骤2)中的酶切产物连接，得到卡那霉素pUC57；

4)以猪圆环病毒2型为模板设计一对引物pUC57-KAN-R及pUC57-KAN-F，猪圆环病毒2型具有序列表中序列12的核苷酸序列，引物分别具有序列表中序列10～11的核苷酸序列；

5)将步骤4)中的引物进行扩增，对扩增产物进行酶切；

6)将卡那霉素pUC57载体进行酶切，得到的酶切产物与步骤5)中的酶切产物连接，在卡那霉素平板上挑选白色菌落，培养并测序，得到pUC57卡那霉素抗性前T载体。