[发明专利]一种前T载体、T载体及其制备方法

权利要求书

1.一种前T载体，其特征在于，所述前T载体具有序列表中序列13的核苷酸序列。

2.一种T载体，其特征在于，采用Eaml105I限制性内切酶酶切所述前T载体，得到pUC57卡那霉素抗性T载体。

3.一种前T载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计酶切位点将pUC57载体上的氨苄青霉素基因剪切下来，并以此为模板设计三对引物：KAN-F与KAN-R，AlwNI-F与AlwNI-Kan-R及Kan-AatII-F与AatII-R，所述三对引物具有序列表中序列1～6中的核苷酸序列；

2)将pET28-a的卡那霉素基因扩增下来，将所述卡那霉素基因与上游酶切位点间的序列及所述卡那霉素基因与下游酶切位点间的序列扩增下来，分别得到片段KAN、片段AlwNI-Kan及片段Kan-AatII，所述三个片段分别具有序列表中序列7～9的核苷酸序列，利用overlapping技术连接所述片段KAN、片段AlwNI-Kan、片段Kan-AatII，将得到的PCR产物进行双酶切；

3)将氨苄青霉素pUC57进行双酶切，得到的酶切产物与所述2)中的酶切产物连接，得到卡那霉素pUC57；

4)以猪圆环病毒2型为模板设计一对引物pUC57-KAN-R及pUC57-KAN-F，所述猪圆环病毒2型具有序列表中序列12的核苷酸序列，所述引物分别具有序列表中序列10～11的核苷酸序列；

5)将所述步骤4)中的引物进行扩增，对扩增产物进行酶切；

6)将所述卡那霉素pUC57载体进行酶切，得到的酶切产物与所述步骤5)中的酶切产物连接，在卡那霉素平板上挑选白色菌落，培养并测序，得到pUC57卡那霉素抗性前T载体。

4.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中所述片段KAN扩增所采用的载体为pET28-a，所述片段AlwNI-Kan扩增所采用的载体为pUC19，所述片段Kan-AatII扩增所采用的载体为pUC19。

5.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中双酶切所述PCR产物采用的内切酶为AlwNI和AatII。

6.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中双酶切所述氨苄青霉素pUC57采用的内切酶为AlwNI和AatII。

7.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中所述的猪圆环病毒2型为单链环状DNA。

8.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中对所述扩增产物进行酶切采用的内切酶为XbaI及BamHI。

9.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中对pUC57-Kan载体进行酶切采用的内切酶为XbaI及BamHI。