[发明专利]一种骆驼蓬脂转移蛋白基因及重组表达和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种来自骆驼蓬中的脂转移蛋白基因PhLTP，以及制备获得重组骆驼蓬脂转移蛋白的方法及其在抑菌和抗肿瘤方面的应用。

背景技术

植物体在受到病原菌的侵害时，首先产生的防御机制便是抗菌蛋白，其作用范围较广，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌、原虫、寄生虫及含有外套膜的病毒，而且也有研究报告指出抗菌蛋白能够抑制肿瘤细胞的生长。抗菌蛋白广泛存在于自然界许多生物体中，是一道天然的防御系统，其中，病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)、防御素(defensins)、核糖体失活蛋白(ribosome.inactivating proteins，RIPs)和脂转移蛋白(lipid transfer protein，LTP)等都起着非常重要的作用。

脂转移蛋白是一类分子量相对较小的碱性蛋白质，在植物、动物、酵母、真菌和一些细菌中均有发现。在动物中有特异脂转移蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)和非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTP)，在植物中因其脂转移活性具有广泛性和不确定性，植物中至今只发现有nsLTP。植物中nsLTP能够转移磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸，并能够促进微体和线粒体之间的磷脂交换。现在已从多种植物中分离得到nsLTPs，如玉米、水稻、大麦、谷子、洋葱、豇豆、白菜、菠菜、甜桔、箩卜、桃和拟南芥等。在植物中非特异脂转移蛋白都是可溶性蛋白，可以达到可溶蛋白总量的4％。由于植物nsLTPs具有很强的抗真菌和细菌的活性，所以被列为植物防御蛋白系列。然而目前一些研究还发现植物nsLTPs还具有较强的抗肿瘤活性。近年来，从传统中草药中继续挖掘具有应用价值的蛋白质或多肽，已经成为一个重要的研究热点。

骆驼蓬(Peganum harmala L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属(Peganum)多年生药用草本植物，已列入维吾尔药卫生部药品标准。多分布于干旱草地、盐碱化荒漠地带。骆驼蓬富含多种生物碱，具有抗癌、消炎、抗病毒等多种药理及杀虫抑菌活性，这些生物活性引起了人们对野生骆驼蓬资源的关注。本发明首次从骆驼蓬幼叶中克隆出脂转移蛋白基因并构建表达载体进行重组表达，该重组表达蛋白具有抑菌和抗肿瘤活性的作用，未见现有文献报道。本发明为科学认识骆驼蓬中活性蛋白的功能提供依据，对脂转移蛋白以及其他类型抗菌蛋白的研究不仅具有重要的理论意义，在抗微生物感染和抗肿瘤药物的治疗方面也具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明涉及一种骆驼蓬脂转移蛋白基因，并提供重组骆驼蓬脂转移蛋白PhLTP在大肠杆菌中高效表达的方法，证明该重组表达蛋白的用途，以扩大药用植物骆驼蓬的应用范围。

本发明所述骆驼蓬脂转移蛋白基因，具有序列表SEQ ID NO.1中所示的碱基序列，全长为348bp，其编码一种骆驼蓬脂转移蛋白，具有序列表SEQ ID NO.2中所示的由115个氨基酸组成的氨基酸序列，其中含有8个半胱氨酸残基，分别在序列表SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列中第29、39、54、55、75、77、100和114的位置上。

本发明提供了一种骆驼蓬脂转移蛋白基因在大肠杆菌中高效重组表达的方法和应用，包括如下步骤：

(1)骆驼蓬总RNA的提取和反转录合成cDNA：将骆驼蓬种子萌发6天后，取幼叶放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，使用Trizol试剂提取总RNA；用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测其总RNA质量，A260/280约2.0为纯度较好；以总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用反转录酶M-MLV(RNase H-)，合成cDNA；

(2)PCR扩增骆驼蓬脂转移蛋白基因(PhLTP)：根据登录在国际检索数据库NCBI上的其他植物脂转移蛋白的cDNA序列，设计并合成一对简并引物，以步骤(1)合成的cDNA为模板，经聚合酶链式反应(PCR)扩增出348bp的DNA片段，回收PCR产物并纯化后，克隆到T载体pCR2.1上，对阳性转化子进行菌落PCR检测，酶切鉴定重组质粒插入片段的大小正确后，进行测序分析，鉴定获得正确的骆驼蓬脂转移蛋白基因PhLTP；