[发明专利]一种骆驼蓬脂转移蛋白基因及重组表达和应用

权利要求书

1.一种骆驼蓬脂转移蛋白基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO.1中所示的碱基序列，全长为348bp，其编码一种骆驼蓬脂转移蛋白，具有序列表SEQ ID NO.2中所示的由115个氨基酸组成的氨基酸序列，其中含有8个半胱氨酸残基，分别在序列表SEQID NO.2中所示的氨基酸序列中的第29、39、54、55、75、77、100和114的位置上。

2.根据权利要求1所述的重组骆驼蓬脂转移蛋白的获得方法和应用，包括如下步骤：

(1)骆驼蓬总RNA的提取和反转录合成cDNA：将骆驼蓬种子萌发6天后，取幼叶放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，使用Trizol试剂提取总RNA；用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测其总RNA质量，A260/280约2.0为纯度较好；以总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用反转录酶M-MLV(RNase H-)，合成cDNA；

(2)PCR扩增骆驼蓬脂转移蛋白基因(PhLTP)：根据登录在国际检索数据库NCBI上的其他植物脂转移蛋白的cDNA序列，设计并合成一对简并引物，以步骤(1)合成的cDNA为模板，经聚合酶链式反应(PCR)扩增出348bp的DNA片段，回收PCR产物并纯化后，克隆到pCR2.1载体上，对阳性转化子进行菌落PCR检测，酶切鉴定重组质粒插入片段的大小正确后，进行测序分析，鉴定获得了正确的骆驼蓬脂转移蛋白基因PhLTP；

(3)构建重组质粒pET30a-PhLTP及相应的重组基因工程菌：设计特异性引物用于扩增获得PhLTP基因核酸序列，经双酶切将PhLTP亚克隆至经同样双酶切的pET30a载体中，构建重组表达质粒pET30a-PhLTP；转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得基因工程菌，简称E.coli BL21/pET30a-PhLTP；

(4)重组质粒pET30a-PhLTP的高效表达及纯化：以LB为基础培养基，将基因工程菌E.coli BL21/pET-30a-PhLTP经过IPTG诱导培养获得可溶性的重组表达蛋白，其中培养温度是28℃，pH 7.0；离心收集菌体，采用超声波破碎法裂解细胞，离心获得上清可溶性蛋白，通过金属镍螯合柱层析方法纯化，获得重组骆驼蓬脂转移蛋白，经SDS-PAGE电泳检测证明得到了可溶性、高效表达的重组骆驼蓬脂转移蛋白PhLTP。

(5)重组骆驼蓬脂转移蛋白的功能活性和应用

上述步骤(4)得到的纯化的重组骆驼蓬脂转移蛋白PhLTP具有抑菌和抑制肿瘤活性，在病原微生物感染和在肿瘤的药物治疗方面具有良好的应用前景。

3.权利要求1～2任一一项所述的重组骆驼蓬脂转移蛋白，其特征是：所述重组蛋白具有抑菌作用，在制备治疗病原微生物感染的抗菌药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征是：所述细菌是肺炎克雷伯氏菌(klesiella peneumoniae)，大肠埃希菌(Escherichia coli Atc25922)，类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)等3种病原细菌。

5.权利要求1～2任一一项所述的重组骆驼蓬脂转移蛋白，其特征是：所述重组蛋白具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，在制备治疗肿瘤药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征是：所述的肿瘤为宫颈癌、食管癌和黑色素瘤。