[发明专利]获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法

说明书

技术领域

发明涉及一种利用基因枪介导外源基因表达载体片段转化植物的方法，此方法获得的转基因植株除目的基因外不含多余垃圾DNA，而且外源目的基因为单拷贝整合，是一种植物转化技术。属于生物学领域，特别涉及到基因工程技术。

背景技术

自1983年第一例转基因植物诞生以来，植物基因导入技术日臻完善，形成了以基因枪和农杆菌两大转化技术为主体的植物基因转化系统。随着转基因农作物的商品化种植，转基因植物潜在的生态环境危害以及由之而来的遗传修饰食品对人类的食用安全性，已成为转基因农作物推广应用的重要障碍。

转基因植物中存在的抗性选择标记基因是导致转基因植物安全性问题的根源之一。转基因植物中的抗性选择标记基因在植物转化过程中用来区分转化和非转化细胞，赋予转化细胞对除草剂或抗生素抗性的抗性标记基因是植物转化中普遍使用也是最有效的筛选标记基因，对植物细胞转化处理后，通过在培养基中加入相应的除草剂或抗生素对细胞进行筛选来获得转化细胞。由于目前的基因导入技术只能将外源基因导入少数细胞中，所以在导入目的基因的同时必须引入抗性选择标记基因才能实现对植物细胞的有效转化。转基因植株再生后，这些抗性选择标记基因通常不再具有应用价值，但除草剂抗性基因可能通过基因漂移传递给近缘物种，产生恶性杂草，对生态环境造成危害；抗生素抗性基因可能通过基因漂移转移给土壤微生物或通过食物链转移至人类肠道微生物，使人对相应抗生素产生抗性，影响人类健康。因此如何在植物转化成功后田间释放前剔除抗性选择标记基因解决转基因植物安全性问题的必要程序。

目前通常将抗性标记基因与目的基因共转化，筛选获得转基因植株后再剔除标记基因是获得无选择标记基因的转基因植物的有效途径。已经建立的标记基因剔除系统主要包括四种：转座子介导目的基因再定位系统、共转化和遗传分离系统、重组酶介导标记基因剪切系统和依赖染色体内同源重组的标记基因切除系统(Sreekala C，Wu L，Gu Wang D，Tian D Excision of a selectable marker in transgenic rice(Oryza sativa L.)using a chemically regulated CRE/loxP system.Plant Cell Rep，2005，24：86-94)。其中基于P1噬菌体Cre/loxP系统发展的标记基因剪切系统应用最为广泛。1991年，Dale和Ow首次利用重组酶Cre可将位于两个同向排列的loxP位点之间的外源DNA序列选择性地切除这一特性，通过重组酶Cre基因二次转化获得完全剔除了筛选标记基因的转基因烟草植株(Dale EC，Ow DW(1991)Gene transfer with subsequent removal ofthe selection gene from the host genome.Proc Natl Acad Sci USA 88：10558-10562)。近年来，利用Cre/loxP这一系统消除标记基因得到了快速发展。2000年，Zuo等建立了一种化学诱导植物基因表达系统XVE，雌激素诱导驱动Cre基因的表达，将雌激素诱导Cre基因表达系统和抗性标记基因同置于两个正向排列的LoxP位点之间，设计构建了雌激素诱导的标记基因诱导剪切系统，成功实现了转基因植物中抗性标记基因和为了切除抗性标记基因而引入的Cre基因表达序列(简称为抗性标记基因相关序列，resistant marker gene related sequences，缩写为RMGRS)的一次性可控删除(Zuo J，Niu QW，Chua NH.An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants.Plant J，2000，24：265-273)。随后基于上述思路，研究者又发展了一些新型诱导表达型启动子如玉米乙酰苯胺类化合物瞬间诱导启动子(In5-2)(Yuan Y，Liu YJ，Wang T.ANew Cre/lox System for Deletion of Selectable Marker Gene.Acta Botanica Sinica，2004，46(7)：862-866.)、热诱导启动子(Cuellar W，Gaudin A，Solorzano D，Casas A，Nopo L，Chudalayandi P，Medrano G，Kreuze J，Ghislain M.Self-excision of the antibiotic resistance gene nptII using a heat inducibleCre-loxP system from transgenic potato.Plant Mol Biol 2006，62：71-82)和地塞米松诱导启动子(李文旭，基于Cre/loxP系统诱导删除抗生素基因植物表达载体的构建，硕士学位论文，福建农林大学，2009，P16-17)等来诱导Cre基因表达以实现转基因植物中RMGRS的一次性可控删除。但上述研究技术存在的缺陷有两个：