[发明专利]获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法

权利要求书

1.获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、植物抗性标记基因诱导剪切表达载体的构建：按照基因构建的分子生物学方法构建植物抗性标记基因诱导剪切表达载体质粒，其中用做基因枪轰击的外源基因片段序列结构如下：在该外源基因片段序列两侧各设置相应的限制性酶切位点A和限制性酶切位点B，以便把该片段从质粒载体上切割下来；

2)、外源基因序列DNA片段的制备：采用限制性内切酶将上述步骤1)构建好的外源基因片段序列从质粒载体上切割下来，通过凝胶电泳分离割胶回收，作为基因枪轰击植物细胞的外源DNA；

3)、DNA微弹载体悬液制备；

4)、植物愈伤组织基因枪轰击转化；

5)、抗性愈伤组织的筛选：

依据抗性标记基因的类型采用相应的筛选剂，按植物基因转化的方法对转化愈伤组织进行筛选，获得抗性愈伤组织；

6)、直接在抗性愈伤组织预分化或分化阶段进行重组酶诱导表达对标记基因相关序列进行剪切处理；

根据诱导启动子表达所需进行重组酶的诱导表达处理，就能将介于和之间的抗性标记基因相关序列切除；从而分化获得再生植株；

7)、转基因植株的分子检测：

按上述转化步骤获得的再生植株，利用PCR技术对目标基因表达框、抗性标记基因、重组酶基因序列分别设计合适引物对，对转基因植株进行PCR分子检测，挑选出目标基因表达框PCR(+)、抗性标记基因PCR(-)、重组酶基因PCR(-)的转基因植株，所述转基因植株为单纯目的基因表达框整合的转基因植株；

8)、单拷贝目的基因表达框整合的转基因植株的获得和分子鉴定：

对上述步骤7)挑选出目标基因表达框PCR(+)、抗性标记基因PCR(-)、重组酶基因PCR(-)的转基因植株，采用Southern杂交技术鉴定目的基因表达框整合的拷贝数，确定单拷贝整合的转基因植株。

2.根据权利要求1所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤1)载体构建时确保所需外源基因片段序列两侧各设置相应的限制性酶切位点A和B，以便把该片段从质粒载体上切割下来，所述限制性酶切位点A和B包括根据载体构建所需的所有合适可用的限制性酶切位点。

3.根据权利要求1或2所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤1)载体构建时将包括抗性标记基因及其重组酶诱导剪切系统在内的所有DNA元件置于和之间，并与目的基因表达框相邻接，确保转化时外源DNA片段组成的有效性和完整性，所述和包括所有构建时使用的所有重组酶的相应酶切位点。

4.根据权利要求3所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤4)中的基因枪为Biolistic PDS 1000/He基因枪。

5.根据权利要求4所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤6)中的直接在抗性愈伤组织预分化或分化阶段进行重组酶诱导表达对标记基因相关序列进行剪切处理，其中包括根据诱导启动子表达所需在预分化或分化培养基中添加合适浓度的诱导剂，但不限于在培养基中添加诱导剂这一种处理，也适合于重组酶诱导表达所需的其他相应处理，并且预分化和/或分化培养基中不再添加筛选剂，获得再生植株。

6.根据权利要求2、3、4或5所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述步骤8)的所获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植转基因植株的挑选为：将步骤7)所得的再生植株，直接在分子水平上验证。

7.根据权利要求6所述的获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，其特征是：所述植物为水稻，但不限于水稻，也适用于采用该方法获得的其他转基因植物。