[发明专利]用于鉴定ACC脱氨酶结构基因的引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于应用微生物技术领域，具体涉及针对微生物1-氨基环丙烷-1羧酸(ACC)脱氨酶结构基因设计的通用特异性简并引物和用聚合酶链式反应(PCR)从根瘤菌等细菌中扩增ACC脱氨酶结构基因(acdS)的方法。

背景技术

植物遭受旱涝、盐碱、高低温、重金属等逆境胁迫和病原微生物侵染会应激产生大量植物激素乙烯。高水平的乙烯会抑制植物根伸长、促植物器官衰老和脱落、加重病症。ACC是植物合成乙烯的直接前体。有些定殖在植物体内外的细菌能吸收植物细胞分泌出来的ACC，并用ACC脱氨酶催化ACC脱氨基反应，生成α-酮丁酸和NH₃作为细菌生长所需的碳氮源。与此同时，植物细胞内的ACC浓度下降，相应地ACC氧化成乙烯的量降低，从而消减在逆境下乙烯对植物生长的抑制，延缓植物器官的衰老或病害的发展。由于植物不能靠运动选择适宜生长的地方而免不了生长在逆境中，与植物紧密联合的有ACC脱氨酶的细菌往往会比有固氮、溶磷或分泌铁载体等特性的细菌更易产生促植物生长的效应；ACC脱氨酶也就被认为是细菌促植物生长的一种重要特性(Glick et al.Critical Reviews of Plant Sciences 2007，26：227-242)。随着全球气候变暖，自然灾害频发，环境污染日益严重，利用微生物帮助植物抗逆和修复污染的土壤和水体受到人们的重视，大量的有ACC脱氨酶的细菌被分离和筛选出来，显示出促植物生长、抗逆和清除污染物的效益。

根瘤菌与豆科植物共生体系的固氮能力是自然界多种生物固氮体系中最强的，固氮量占地球生物固氮量的65％以上。根瘤菌若能高效结瘤和固氮，一方面侵染力要强，能够躲避或压制植物把根瘤菌作为外来入侵物而产生的防卫反应，另一方面要适应植物的生存环境，能耐受干旱、高盐、偏酸碱或高低温等逆境或称非生物胁迫。筛选能耐受非生物胁迫的根瘤菌只需操作自由培养状态的根瘤菌，相对便捷。筛选侵染力强的根瘤菌，通常要逐一接种相应的豆科植物，培养一段时间后，检测根部的结瘤数和接种根瘤菌的占瘤率；若要从数量较多的根瘤菌菌株中筛选出侵染力强的菌株往往需要较大的培养空间，耗时耗力。

早在20世纪70年代就有研究发现乙烯抑制根瘤菌结瘤和固氮，90年代的研究发现根瘤菌侵染引发豆科植物产生ACC和乙烯，近十年的研究发现有些根瘤菌有ACC脱氨酶，它们的ACC脱氨酶结构基因(acdS)在根瘤中的表达量很高，如果把根瘤菌的acdS敲除，根瘤菌的结瘤能力会显著降低(Uchiumi et al.Journal of Bacteriology 2004，186：2439-2448)；相反，如果向原本没有ACC脱氨酶的根瘤菌导入acdS，那根瘤菌工程菌的结瘤率、占瘤率和固氮效率显著高于野生型菌株(Ma et al.Applied and Environmental Microbiology 2004，70：5891-5897)。有一研究检测了10个商业化生产应用的根瘤菌菌株发现有一半(5个)的菌株有acdS和ACC脱氨酶活性(Ma et al.Antonie van Leeuwenhoek 2003，83：285-291)。这些研究都表明有ACC脱氨酶的根瘤菌有强的侵染力，能高效结瘤；筛选有ACC脱氨酶的根瘤菌能更可预测地实现与豆科植物高效结瘤固氮。