[发明专利]可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中利用基因工程方法载体构建的技术领域。

背景技术

家蚕是一种重要的经济动物，具有易于饲养、成本低廉等特点。以家蚕作为宿主的杆状病毒表达系统表达外源蛋白的产量高、成本低且质量好，因此具有广阔的市场开发前景。并且，这种表达系统安全性好，外源基因表达水平高，并可进行翻译后加工，是一种比较理想的真核表达系统，因此该系统已得到非常广泛的应用。通过改造杆状病毒载体，该系统在重组病毒的构建效率、外源基因的表达水平和表达通量方面不断得到提升。其中，以核型多角体病毒BmNPV为载体的家蚕杆状病毒表达系统也先后发展出可线性化病毒载体、Bacmid穿梭载体，但这些载体均无法用于外源基因的高通量表达。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，本发明所得的BmBacmid既可作为Bac-to-Bac系统的穿梭载体使用，也可作为一种线性化病毒载体使用，并可用于建立一套新型的BmNPV高通量载体表达系统。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，包括如下步骤：

1)、构建pBacAvrII2载体：在pBacPAK8载体上引入限制性内切酶位点FseI和AvrII；从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2(即，pBacAvrII2载体)；

2)、构建含细菌人工染色体BAC的pBACAvrII2载体：

设计一对两端含FseI位点的引物，从DH10Bac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2载体；

3)、家蚕杆状病毒表达载体-----可线性化穿梭载体BmBacmid的构建：

以pBACAvrII2载体为模板，PCR扩增BAC的片段，BAC的片段含两个AvrII和FseI酶切位点、且片段两端为多角体基因侧翼序列，然后将PCR产物和线性化的BmBacPAK共转染家蚕细胞，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得BmBacmid载体，所述BmBacmid载体为可线性化穿梭载体BmBacmid。

作为本发明的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法的改进：

步骤1)为：

pBacAvrII2载体是在pBacPAK8载体的基础上进行改造，成功引入两个AvrII位点；依次进行以下步骤：

①、第一个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII1载体：

对转移载体pBacPAK8DNA多角体基因启动子3′端侧翼的orf1629基因进行定点突变，将TTTAGG突变为CCTAGG，为AvrII位点，从而在SnaBI和SwaI之间，即在orf1629基因的3′端引入第一个AvrII酶切位点；

②、第二个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII2载体：

在pBacAvrII1载体DNA上的EcoRV和BamHI位点之间引入一段DNA序列；序列包含FseI和AvrII两个酶切位点，从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2。

作为本发明的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法的进一步改进：

步骤3)为依次进行以下步骤：

①、扩增pBACAvrII2载体中BAC片段：

为了使BAC片段能与线性化BmBacPAK同源重组，故从pBACAvrII2上扩增两端含多角体基因侧翼序列的BAC片段；以pBACAvrII2为模板，用KOD-FX DNA聚合酶PCR扩增合成BAC片段；

②、线性化BmBacPAK制备：

家蚕杆状病毒BmBacPAK先经蛋白酶K消化后通过苯酚氯仿抽提获得病毒DNA，所述病毒BmBacPAK DNA含有三个Bsu36I酶切位点，故通过Bsu36I酶切进行线性化，得到Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA；

③、BmBacmid的构建：

将上述步骤①中PCR产物与上述步骤②所得的Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA按照2∶1的分子数之比共转染家蚕BmN细胞，待细胞完全病变后收集培养上清分离病毒，并提取病毒基因组DNA；