[发明专利]可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法

权利要求书

1.可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，其特征是包括如下步骤：

1)、构建pBacAvrII2载体：在pBacPAK8载体上引入限制性内切酶位点FseI和AvrII；从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2；

2)、构建含细菌人工染色体BAC的pBACAvrII2载体：

设计一对两端含FseI位点的引物，从DH10Bac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2载体；

3)、家蚕杆状病毒表达载体-----可线性化穿梭载体BmBacmid的构建：

以pBACAvrII2载体为模板，PCR扩增BAC的片段，所述BAC的片段含两个AvrII和FseI酶切位点、且片段两端为多角体基因侧翼序列，然后将PCR产物和线性化的BmBacPAK共转染家蚕细胞，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得BmBacmid载体，所述BmBacmid载体为可线性化穿梭载体BmBacmid。

2.根据权利要求1所述的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，其特征是：

所述步骤1)为：

pBacAvrII2载体是在pBacPAK8载体的基础上进行改造，成功引入两个AvrII位点；依次进行以下步骤：

①、第一个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII1载体：

对转移载体pBacPAK8DNA多角体基因启动子3′端侧翼的orf1629基因进行定点突变，将TTTAGG突变为CCTAGG，为AvrII位点，从而在SnaBI和SwaI之间，即在orf1629基因的3′端引入第一个AvrII酶切位点；

②、第二个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII2载体：

在pBacAvrII1载体DNA上的EcoRV和BamHI位点之间引入一段DNA序列；所述序列包含FseI和AvrII两个酶切位点，从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2。

3.根据权利要求2所述的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，其特征是：

所述步骤3)为依次进行以下步骤：

①、扩增pBACAvrII2载体中BAC片段：

为了使BAC片段能与线性化BmBacPAK同源重组，故从pBACAvrII2上扩增两端含多角体基因侧翼序列的BAC片段；以pBACAvrII2为模板，用KOD-FX DNA聚合酶PCR扩增合成BAC片段；

②、线性化BmBacPAK制备：

家蚕杆状病毒BmBacPAK先经蛋白酶K消化后通过苯酚氯仿抽提获得病毒DNA，所述病毒BmBacPAK DNA含有三个Bsu36I酶切位点，故通过Bsu36I酶切进行线性化，得到Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA；

③、BmBacmid的构建：

将上述步骤①中PCR产物与上述步骤②所得的Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA按照2∶1的分子数之比共转染家蚕BmN细胞，待细胞完全病变后收集培养上清分离病毒，并提取病毒基因组DNA；

以病毒基因组DNA电转化ElectroMAX DH10B感受态细胞，涂含Kan、IPTG和X-gal的LB平板培养24h，挑取状态良好的蓝斑接种LB液体培养基，振荡培养48小时后提取Bacmid DNA；将提取的Bacmid DNA转染家蚕细胞，产生细胞病变的即为可线性化穿梭载体BmBacmid。