[发明专利]一种白藜芦醇的生物生产方法

说明书

技术领域

本发明所属生物医药技术领域，更具体说，特别涉及一种白藜芦醇的生产方法。

背景技术

白藜芦醇(resveratrol，res)，其化学名为3，4’，5-三羟基-反式-二苯乙烯，也称芪三酚，分子式为C₁₄H₁₂O₃，分子量为228.2。纯品为无色针状晶体，难溶于水(25℃时为0.03g/L)，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。随着对白藜芦醇的研究的不断深入，人们发现白藜芦醇具有广泛的生理药理活性，包括抗癌活性、抗氧化作用、保护心血管作用、清除自由基、抗炎作用、抗菌作用、免疫调节作用、雌激素样活性等。因此，白藜芦醇在保健品、化妆品、药品等领域拥有广阔的市场前景。

白黎芦醇属于非黄酮类的多酚化合物，在自然界分布广泛，目前至少在21个科，31个属的72种植物中发现。到目前为止，从植物中提取仍是生产白藜芦醇的最主要的方法。国外主要从葡萄皮和葡萄籽中提取，国内则从中药虎杖等中提取。我国目前是白藜芦醇植物提取物的主要生产国家。提取方法为先用溶剂渗滤提取或加热回流提取，再对提取物进行萃取分离。提取溶剂多用甲醇、乙醇和乙酸乙酯。此法存在周期长、有效成分损失大、提取率低等缺点。近年来出现了一些新的提取技术，如酶提法、CO₂超临界萃取法、微波萃取法、超声萃取法等等。但仍然不能解决植物提取法面临的根本问题，如植物原料受限和质量不稳定、生产能力低、种植受到季节和地理位置的限制等等。虽然已有化学全合成白藜芦醇的报道，但步骤复杂，产率低，环境污染严重。

近年来，随着生物技术的不断进步，使用重组微生物生产白藜芦醇成为备受关注的方法。白黎芦醇的生物合成途径属于苯丙氨酸-丙二酸途径。白藜芦醇的从头生物合成途径为：以L-苯丙氨酸为底物，经苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine lyase PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase C4H)催化，或以L-酪氨酸为底物，酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase TAL)催化生成对香豆酸；再经4-香豆酰辅酶A连接酶(coumaroyl-CoA4CL)、白藜芦醇合酶(resveratrol synthase RS)，最终生成白藜芦醇。Watts等将拟南芥的4CL基因和花生的RS基因转入大肠杆菌中，在培养基中加入对香豆酸为底物，合成了白藜芦醇。Katsuyama等将深红酵母的PAL、紫草的4CL和花生的RS基因同时转入大肠杆菌中，以酪氨酸为底物，合成了白藜芦醇。专利CN101160393使用L-苯丙氨酸或者L-酪氨酸为底物，使用PAL、C4H、4CL、RS或者TAL、4CL、RS在酵母中合成了白藜芦醇。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种改进的白藜芦醇的生物生产方法，通过构建重组工程菌株，在不添加底物的情况下实现白藜芦醇的从头合成，使生产成本最低化。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

一种白藜芦醇的生物生产方法，按照下述步骤进行：

首先(即步骤1)设计并优化苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)、酪氨酸氨解酶基因(TAL)、4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL)和白藜芦醇合酶(RS)的基因序列，并全合成这些目标基因；

其次(即步骤2)使用酶切连接的方法将获得的目标基因连接到表达载体上；

然后(即步骤3)将构建好的表达载体转化到菌株中，得到重组工程菌株；

最后(即步骤4)对重组菌株进行发酵，并从发酵产物中分离纯化白藜芦醇。

上述步骤1中设计并优化后获得的基因序列如序列表所示。

其中所述苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)优选斯氏假单胞杆菌的苯丙氨酸羟化酶基因序列，使用jcat(http://www.jcat.de)对其进行密码子优化，用于在大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达，优化后的基因长度为786bp，序列如序列表SEQID NO.1所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。

所述酪氨酸氨解酶基因(TAL)优选黄孢原毛平革菌的酪氨酸氨解酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，用于在大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达，优化后的基因长度为2214bp，序列如序列表SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。