[发明专利]萘啶霉素的生物合成基因簇

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗肿瘤抗生素萘啶霉素的生物合成基因簇，基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

技术背景：

四氢异喹啉生物碱是一类结构复杂而独特的天然产物家族，均具有良好的抗菌和抗肿瘤活性[Chem.Rev.(2002)102，1669-1730]。1974年，加拿大科学家Kluepfel等人从复活岛土壤中分离得到一种具有良好抗肿瘤活性的天然产物；并且，通过菌种分离发现，它是由土壤中的一种葡萄牙链霉菌(Streptomyces lusitanus AYB-1026)所产生的次级代谢产物。由于其良好的抗菌活性，Sygusch等人通过发酵的方法分离纯化得到了这种天然产物，常温下它是一种宝石红的晶体。通过X-ray晶体衍射分析的方法Sygusch首次确定了这种天然产物的化学结构，并把它命名为Naphthyridinomycin——萘啶霉素。1994年，Lederle实验室又从Streptomyces viridostaticus ssp litoralis的发酵液中分离得到了萘啶霉素的四种结构类似物bioxalomycins(α₁，α₂，β₁，β₂，图1)，它们均表现出良好的生物活性。研究表明：萘啶霉素类生物碱是一种很好DNA烷基化试剂或交联剂，它们在较低的浓度(约0.2μg/mL)下就能够很大程度地抑制DNA合成，在一定浓度下也能够抑制RNA和蛋白质的合成。基于前人的研究，Willams和Herberich的实验结果揭示出bioxalomycin a2实际上在双链的DNA之间可以形成了一个双链DNA交联。

到2000年，生物学家又分离得到了一系列与之结构类似的化合物，统称为四氢异喹啉家族；这些化合物都是以苯醌并环和芳并环为基本核心骨架结构。根据结构上的细微的差异，这几十个结构相似的化合物被分作了三个家族：Naphthyridinomycins家族，Saframycins家族和Quinocarcins家族。

前体标记实验表明：萘啶霉素腈基取代物的并环骨架主要来自于三种氨基酸——L-tyrosine(酪氨酸)，D、L-ornithine(鸟氨酸)，glycine(甘氨酸)[J.Antibiot.1985，38，819]：其中苯醌的六元环来自一个L-tyrosine(实际上，酪氨酸首先是由L-methionine甲基化，再经过一步氧化还原反应实现间位的羟化)，边上的两个六元环来自于一个鸟氨酸，而上面的五员环来则自于由两个甘氨酸缩合得到的serine(丝氨酸)，O-、C-、N-的甲基均来自于L-methionine(甲硫氨酸)。

目前，一个来源于加勒比海的一种海鞘(Ecteinascidia turbinate)中的四氢异喹啉天然产物Et 743(见图1)引起了广大生物学家的关注。该化合物体外活性LC₅₀＜1pM，ID₅₀0.2-0.6nM，活性比抗肿瘤药物紫杉醇高约50倍[Clin.Can.Res.(2002)8，75-85]。作为西班牙生物技术公司PharmaMar(Zeltia)主导的抗癌药，ET-743在欧洲的上市申请已获得批准，主要用来治疗经传统化疗治疗无效的晚期软组织肉瘤患者。而在美国和其它国家，PharmaMar已将ET-743的研发和商业开发权授让给Johnson&Johnson。由于ET-743已被欧盟承认为治疗软组织肉瘤的罕用药物，PharmaMar认为该药的全球年销售额将达10亿美元。目前该药还处于治疗乳腺癌、直肠癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌、黑色素瘤、骨肉瘤、间皮瘤的II期试验和卵巢癌的III期试验。