[发明专利]人源糖基化改造的汉逊酵母

说明书

技术领域

本发明涉及人源糖基化改造的汉逊酵母。

背景技术

越来越多的医用疫苗、治疗性蛋白、多肽等可以通过基因重组技术生产，并在临床治疗中发挥着重要作用。其中糖蛋白类药物是基因工程药物发展的主体，其需求不断地迅速增长。糖蛋白中蛋白是生理功能的主要承担者，糖链则对蛋白的功能起到修饰作用。许多蛋白质功能的实现都与糖基化修饰密切相关。糖链可以改变蛋白质的构象，从而导致蛋白功能发生改变。糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用，并参与受体激活、信号转导等诸多重要的生物进程。

至今，哺乳动物细胞是唯一能生产类似于人的复杂型糖基修饰的糖蛋白药物表达系统，但该表达系统成本高，难以放大，严重制约了治疗性糖蛋白药物产业的发展。酵母作为最简单的真核生物，虽然具有培养成本低，可高密度发酵和易于大规模生产等优点，但它合成的糖蛋白糖基是高甘露糖型结构，这种糖基结构在体内存在易被清除、高免疫原性等问题，一般不能作为治疗药物。另外真核生物产生的天然糖蛋白广泛存在不均一性，即在一种给定的蛋白质的同一糖基化位点的聚糖结构有一定范围的变化，甚至这种不均一性程度在不同的位点、不同的蛋白和不同的细胞之间也有相当大的差异。为确保药品的药效、安全性和均一性，重组糖蛋白的糖基化形式也是很重要的。

糖蛋白上的糖链从连接方式上可分为两类：一类是与天冬氨酸(Asn)残基连接，即N-连接糖蛋白；另一类与丝氨酸或苏氨酸连接，称为O-连接糖蛋白。由于N-糖链位点保守、功能重要，糖基工程的研究目前主要集中在这N糖链上。N-糖基化修饰指包含N-乙酰葡萄糖胺残基的糖链与多肽中的天冬酰胺(Asn)残基的酰胺氮相连接，糖链的主要组分包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸。糖基化修饰主要在内质网腔与翻译同时进行，并在高尔基体中继续反应成N-糖基化蛋白。真核细胞中各种N-糖基化加工都起始于内质网，几乎所有的生物在内质网形成的糖基化过程都是保守的。其糖链通常都会有一个五糖核心Man₃GlcNAc₂，具有相同的生物合成起源，即高甘露糖聚合前体Man_5-9GlcNAc₂。该前体并非直接在蛋白质上合成出来的，而是在脂质载体多萜醇(Dol)上合成寡糖链后转运到蛋白质受体上。进一步的糖基化发生在高尔基体，不同真核生物产生不同的糖链结构。

在哺乳动物细胞，甘露糖苷酶I(α1，2mannosidaseI，MnsI)切除多余的甘露糖残基形成Man₅GlcNAc₂；再有N-乙酰葡糖胺转移酶I(β-1，2-N-acetylglucosaminyltransferaseI，GlcNAcTI)在α-1，3-臂添加GlcNAc。由甘露糖苷酶II/III(mannosidaseII/III，MnsII/III)切除α-1，3-Man和α-1，6-Man分支，由N-乙酰葡糖胺转移酶II-VI(N-acetylglucosaminyl transferaseII-VI，GlcNAcTII-VI)继续添加GlcNAc形成二天线型或多天线型结构；最后由岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)、半乳糖基转移酶(galactosyltrnsferase，GalT)、唾液酸转移酶(sialytransferase，ST)添加岩藻糖、半乳糖、和唾液酸形成完整的复杂型N-聚糖。上述各酶依次定位于高尔基体膜上，糖蛋白在从高尔基体运送和向外分泌的过程中逐步被修饰(Helenius 2001)。

然而，在酵母中却发生了一系列由甘露糖转移酶(mannosyltransferase，MnT)催化的高甘露糖基化反应形成含有9-200个甘露糖残基的高甘露糖结构。常见的工程酵母中都存在不同程度的高甘露糖基化并且不同的酵母形成的糖链组成和结构也不尽相同。