[发明专利]在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，为获得可溶性融合表达蛋白研究提供便利，具有广泛的科研价值和应用前景。

背景技术

肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是细菌的一种，由Escherich在1885年发现。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。

肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)(ATP：Creatine N-phosphotransferase EC 2.7.3.2)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，可作为研究蛋白质折叠的理想模型。肌酸激酶在心肌梗塞和骨骼肌疾病等的临床诊断方面是一个很重要的指标。由于肌酸激酶具有的重要的生理功能，所以其得到广泛关注和深入研究。

斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼(Brachydanio rerio)，原产于印度、孟加拉国。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，其基因与人类87％相似，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可作为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力。

异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，能够诱导外源基因的表达，普遍应用于原核表达系统，使其表达量增高，产物稳定，具有易鉴定，易纯化的优点因此被实验室广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种低温、低速、低诱导剂、高效地在大肠杆菌中使由ckmt2基因所编码蛋白可溶性表达的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，包括以下步骤：

1)、将导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液于24～26℃、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0.15～0.25mM，转速150～250rpm的条件下进行诱导表达4～6小时(较佳为5小时)；

所述菌液的OD_600nm为0.4～0.6；

2)、上述步骤1)所得的诱导表达所得的产物经破碎处理后，再离心，所得的破碎后产物上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。

作为本发明的在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法的改进：

步骤2)为：

诱导表达所得的产物先离心，弃上清；所得的菌体中加入PBS重悬后，再经破碎处理直至未见有白色菌体(此时呈澄清的淡黄色均质溶液)；将破碎后所得的产物离心，所得的破碎后产物上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。

一般而言：每1ml步骤1)所得的诱导表达所得的产物配用80～120μL的PBS(PBS缓冲液)进行重悬。

作为本发明的在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法的进一步改进：

所述步骤1)为：将导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液于25℃、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0.2mM，转速200rpm的条件下进行诱导表达5小时。

在本发明中，采用诱导表达后，破碎大肠杆菌后，通过离心、加热等预处理方法，从而获得蛋白，并进行SDS-PAGE验证。

本发明通过实验方法得出以下结论，证明了低温、低速、低诱导剂，能在大肠杆菌中高效使由ckmt2基因所编码的蛋白可溶性表达。此方法具有良好的效果，操作简便，可大规模使用。