[发明专利]血清中PCDH10的TRFIA法检测用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种血清中PCDH10的TRFIA法检测用试剂盒，涉及PCDH10蛋白C-端和N-端的特异性多肽片段的两种特异抗体的制备，并利用所制备的双抗体，采用时间分辨荧光免疫法(TRFIA)检测血清样品中PCDH10方法。属于PCDH10蛋白的抗体制备和时间分辨荧光免疫(TRFIA)分析领域。

背景技术

PCDH10是一个新的肿瘤抑制基因，PCDH10蛋白在血清中的显著降低对一些肿瘤(如大肠癌等)有提示作用。PCDH10是属于Ca²⁺依赖性钙粘蛋白家族的一员，具有6个重复串联的胞外区和1个独特的胞内区。浙江大学朱永良等人在对原代肿瘤干细胞基因表达谱时用病毒文库技术筛选时发现pcdh10^-/-细胞易游出和穿过“Transwell”的半透膜，而pcdh10^+/+的细胞迁移性较弱。通过生物信息学分析，进一步克隆了pcdh10的全长cDNA序列并构建了表达pcdh10的真核细胞表达载体，通过脂质体瞬时转染k562细胞、SW480大肠癌细胞发现异位表达PCDH10抑制了这些细胞在体外的增殖，并增加了细胞的凋亡。进一步发现对这些细进行无血清饥饿和添加化疗药物等处理后PCDH10表达水平随时间和浓度的增加而增加，提示PCDH10参与了细胞凋亡，可能是一个肿瘤抑制基因。然对其参与细胞凋亡的分子机制尚不明了。

浙江大学朱永良等人的发明专利“针对PCDH10C-端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法”(专利号为ZL200810060201)中，利用了PCR技术从体外培养细胞中克隆了PCDH10蛋白的C-端DNA序列并转化入原核细胞中进行表达，获得了纯化的PCDH10C-端多肽，并免疫大白兔，收集并纯化大白兔的抗血清，纯化后获得了PCDH10蛋白C-端多肽的抗体。但尚未发现针对PCDH10蛋白N-端多肽的特异性抗体。所述针对PCDH10C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法的具体步骤是：“1)采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10C端融合蛋白的原核细胞PCDH10C/pETl5b表达载体；2)将PCDH10C/pETl5b表达载体转化BL21 DE3pLysS大肠杆菌，建立PCDH10C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化PCDH10C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10C端融合蛋白N端的His-tag标签，得到PCDH10C端融合蛋白；3)用己切除标签的PCDH10C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生抗PCDH10C端抗体，收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharose亲和柱纯化兔抗PCDH10C端抗体。”

目前市面上尚未有商品试剂盒用于检测该蛋白，所以发明一种简单而高灵敏度的方法来测定血清中PCDH10蛋白含量以评价患癌症的几率，意义非常重大。

时间分辨荧光免疫分析是自上个世纪70年代末80年代初，新发展起来的一项免疫分析方法，它克服了利用荧光素进行荧光免疫分析时背景干扰严重的影响。TRFIA原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，一般采用BHHCT(4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-酰基)-氯磺化邻三联苯)，其一端与镧系元素结合，另一端与抗体(蛋白质)分子中的自由氨基结合，制成镧系元素标记的(一般用Eu³⁺标记)抗体。它与待定抗原结合为免疫复合物。理想情况下，测定复合物中Eu³⁺的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但是实际上这种复合物种镧系元素的荧光强度非常弱，只有加入一种增强液，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-萘甲酰三氟丙酮(β-NAT)重新形成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时光分辨荧光仪测定荧光强度cps，即可确定样品抗原中的量。