[发明专利]血清中PCDH10的TRFIA法检测用试剂盒

权利要求书

1.一种血清PCDH10的TRFIA法检测用试剂盒，具有能与PCDH10C-端融合蛋白结合并被Eu³⁺络合物标记的第二抗体冻干品；该第二抗体冻干品是经1)以聚合酶链式反应将PCDH10C 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10C端融合蛋白的原核细胞表达载体；2)将表达载体转化BL21DE3pLysS大肠杆菌，建立PCDH10C端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化PCDH10C端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10C端融合蛋白N端的His-tag标签，得到PCDH10C端融合蛋白；3)用己切除标签的PCDH10C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生抗PCDH10C端抗体，收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharose亲和柱纯化所得；其特征是：还有包被有具有固相结合部分及能与PCDH10N-端融合蛋白结合的第一抗体的多孔型微量滴度板。

2.权利要求书1所述的试剂盒，其特征是：其中第一抗体为PCDH10N-端融合蛋白的动物抗体；其中第二抗体为PCDH10C-端融合蛋白的动物抗体。

3.权利要求书1所述的试剂盒，其特征是：此检测试剂盒还包括PCDH10标准蛋白冻干品、洗涤液、优选牛血清BSA和增强液。

4.权利要求书1所述的试剂盒，其特征是：其中包被有具有固相结合部分及能与PCDH10N-端融合蛋白结合的第一抗体的制备方法为：

(a)采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10N 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10N-端融合蛋白的原核细胞PCDH10N/PET32a表达载体。其特征是在经逆转录酶转录mRNA获得的cDNA两端设计上游包含BamH I酶切位点之引物和下游包含Hind III酶切位点之引物的cDNA片段经高温多聚酶链式反应扩增为含BamH I和Hind III位点的双链DNA PCDH10N-端基因，然后克隆入PET32a载体的BamH I/HindⅢ位点；

构建PCDH10N-端融合蛋白的具体方法是：将表达PCDH10的1×10⁵～10⁷人白血病K562细胞离心沉淀，加入0.5～1.5ml Trizol充分混匀，提取总RNA，再用逆转录酶转录RNA至cDNA；然后设计上游引物包含BamH I内切酶位点GGATCC和下游引物包含Hind III内切酶位点AAGCTT，通过PCR的方 法直接将PCDH10N-端DNA序列克隆至PET32a BamH I/Hind III位点，经BamH I和Hind III内切酶酶切鉴定合格后，进一步用DNA测序验证，合格即为PCDH10N/PET32a表达载体；

(b)将PCDH10N/PET32a表达载体转化至BL21DE3pLysS大肠杆菌，建立PCDH10N-端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯合树脂纯化PCDH10N-端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10N-端融合蛋白N-端的His-tag标签，得到PCDH10N端融合蛋白；

所述的将PCDH10N/PET32a表达载体转化至BL21DE3pLysS大肠杆菌，建立PCDH10N-端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯合树脂纯化PCDH10N-端融合蛋白，用Thrombin酶切除PCDH10N-端融合蛋白N端的His-tag标签包括如下步骤：

(1)取1～3μl鉴定合格的PCDH10N/PET32a重组质粒加至10～90μl感受态的BL21DE3pLysS大肠杆菌，冰浴15～45min，42℃60s休克，加入50～350μl LB液30～44℃30～90min，涂布含50～150μg/ml的LB平板，37℃孵箱培养过夜，次日，用灭菌牙签挑取单个菌落于一管6～8ml新的LB液中，至37℃孵箱静置过夜，取OD为0.4～0.6的过夜菌液300～1000μl于一管6～8ml新的LB液中，30～44℃扩大培养2～8h，加入终浓度为1～7mM的IPTG诱导0.5～6h，离心收集细菌沉淀；

将细菌沉淀以每克湿重细菌加入1～5ml pH6～8，含0.5～1.5％Trition，0.02～0.08M的磷酸盐缓冲液，重悬细菌，冰浴下超声粉碎细菌，高速冷冻离心区上清液，沉淀继续超声粉碎，高速冷冻离心，合并上清液，上His金属螯合树脂柱，用含5mM咪唑的pH6～8，0.02～0.08M的磷酸盐缓冲液充分洗柱，用5％的柳硫汞检测至无蛋白流出为止，改用含500mM咪唑，pH6～8，0.02～0.08M的磷酸盐缓冲液洗脱，收集流出的蛋白液，装入透析袋，2～8℃对pH6～8、0.005～0.015M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔3～12h换液1次，共3～9次；在透析平衡结束后，用MW10000～30000的聚乙二醇浓缩至0.5～1.5mg/ml，取5～10mg重组蛋白用Thrombin酶切除N-端的His-tag标签，同时通过加入Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到纯化的PCDH10N-端重组蛋白，该蛋白用SDS-PAGE电泳时，5～20μg/lane应无杂蛋白区带发现。

(c)用已切除标签的PCDH10N-端融合蛋白作为抗原免疫动物，产生抗 PCDH10N-端抗体；具体包括如下步骤：

(1)分别取1mg的PCDH10N端重组蛋白与完全福氏佐剂混匀，充分乳化，接种动物皮下3～20余点，每隔5～12天强化免疫1次，待第3～4周末，用0.5～1.5mg PCDH10N端重组蛋白进行直接的兔耳静脉内注射，5～7天后分离动物颈总动脉，剪短放血至三角烧瓶，2～8℃倾斜放置过夜，次日离心收集血清；

(2)将收集的抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、ProteinA-Sepharose亲和柱纯化兔抗PCDH10N-端抗体的方法是：将收集的兔血清用2～6倍预冷的0.005～0.03M，pH 6～8PBS稀释，在不断搅拌的同时缓慢加入1～2倍体积的饱和(NH₄)₂SO₄，2～8℃放置20～30min，离心，去上清，沉淀用0.5～2倍原体积的PBS复溶后，再分别用50％和33.3％的饱和(NH₄)₂SO₄重复沉淀各1次，最后蛋白沉淀用2～3ml PBS复溶后，装入透析袋，2～8℃对0.005～0.03M，pH 6～8PBS透析除盐，每隔3～12h换液1次，加至预经0.01M，pH 6～8PBS平衡的ProteinA-Sepharose柱，流速0.5ml/min，流尽后，用0.02～0.08M，pH 6～8的磷酸盐缓冲液充分洗至无蛋白流出为止，改用3M，pH 6～8硫氰酸钠洗脱结合的IgG，合并洗脱液，2～8℃对pH 6～8、0.005～0.015M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔3～12h换液1次，共3～9次，用MW10000～30000的聚乙二醇浓缩至0.5～1.5mg/ml，分装，-20℃保存。