[发明专利]一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法。

背景技术

L-羟脯氨酸，英文名称hydroxyproline，简称HYP，又名反式-4-羟基-L-脯氨酸，分子式为C₅H₉NO₃，分子量131.13。

L-羟脯氨酸是一种亚氨基酸，通常在脯氨酸的第4位上带有羟基，但有时也在第3位上。L-羟脯氨酸是胶原蛋白所特有的氨基酸，约占胶原蛋白中氨基酸总量的10％，而在其他蛋白质中含量甚微，这使得它几乎成为胶原蛋白所特有的成分，因而可通过测定L-羟脯氨酸含量来计算胶原蛋白的含量，从而确定胶原蛋白的总体水平。

动物胶原水解蛋白是一种廉价蛋白原料，是将牛皮及其制品下脚料等成分粗加工后制成的水解蛋白质，皮革水解蛋白粉就是利用皮革下脚料甚至动物毛发等物质，经水解而生成的一种粉状物，因其氨基酸或者说蛋白含量较高，故人们称之为皮革水解蛋白粉。某些非法厂家在乳粉中掺入廉价的水解动物蛋白来冒充或替代乳蛋白质，提高乳中蛋白的质量分数，降低成本。掺加动物胶原水解蛋白不但会影响乳的口感和风味，改变牛乳的溶解度，因其氨基酸的组成不合理，且不易消化，所以营养价值低下，导致人体吸收利用率降低，会严重影响消费者的健康状况。严格来讲皮革水解蛋白粉对人体健康并无伤害，不过其前提条件是所用皮革必须是未经糅制、染色等人工加工处理过的；然而这样的皮革水解蛋白粉是不存在的，因为经过糅制、染色等人工加工处理过的皮革比直接制作成蛋白粉利润要高得多，因而皮革水解蛋白粉多用皮革厂制作服装、皮鞋后的下脚料来生产，自然这种蛋白粉中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，如果长期食用含有皮革水解蛋白粉的食物，铬重金属离子便会被人体吸收、积累、中毒，使人体关节疏松肿大，甚至造成儿童死亡。

L-羟脯氨酸为人体非必需氨基酸，是机体胶原蛋白(动物水解蛋白)的主要成分之一，含量相对稳定，为胶原蛋白中的特有组分，其含量占10％以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有L(-)-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白。

目前国内对L-羟脯氨酸的检测方法主要有比色法、电泳法、氨基酸自动分析仪法、高效液相色谱法等。

L-羟脯氨酸的传统测定方法是氯胺T比色法，其基本原理是试样经酸水解，释放出L-羟脯氨酸。经氯胺T氧化，生成含有吡咯环的。先把含有HYP多肽的蛋白质、组织、血清、腹水或尿液等水解成游离的HYP，游离的HYP被氧化后再与对二甲氨基苯甲醛(PDAB)在一定温度下发生反应，生成红色的吡咯氧化物，用高氯酸破坏过量的氯胺T。L-羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长558nm处进行通过分光光度计比色测定。氯胺T法的特异性差，灵敏度低，影响因素较多，目前研究及应用的已不多。

柱前衍生高效液相色谱法，主要是先将蛋白水解成L-羟脯氨酸，样品处理最终要求将各肽键断开，释放出游离的L-羟脯氨酸。然后用氨基酸衍生试剂，进行柱前衍生，C18色谱柱分离，通过配紫外检测器或荧光检测器的高效液相色谱仪测定。常见的L-羟脯氨酸衍生剂有邻苯二甲醛、1-氟-2，4-硝基苯、磺酰氯二甲胺偶氮苯、异硫氰酸苯酯等，这些衍生试剂有些还是剧毒的化合物。L-羟脯氨酸衍生步骤比较繁琐，衍生条件限制较多，而且影响检测的准确性，从而限制了其发展前景。另外，也有在200nm波长下直接检测出氨基酸的报道，但检测灵敏度较低，杂质峰干扰较大。

柱后衍生法氨基酸分析仪法，是传统的氨基酸分析方法。前处理与液相法一样，先将蛋白水解成L-羟脯氨酸，样品处理最终要求将各肽键断开，释放出游离的L-羟脯氨酸。然后，利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的pH值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，将L-羟脯氨酸和其他氨基酸及杂质分离开，洗脱下来的L-羟脯氨酸与茚三酮反应后生成黄色产物，在波长440nm有最大吸收，且保留时间不与其他氨基酸重迭。氨基酸自动分析仪法更加快速、准确、自动化程度和灵敏度高，但此法需专门仪器一氨基酸分析仪，该仪器只能用于分析氨基酸，限制了该仪器广泛配置，从而限制了柱后衍生法氨基酸分析仪法在分析乳制品中L-羟脯氨酸中的广泛应用。

因而，探寻一种检测快速、准确、适用于复杂体系乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法，对解决乳制品中非法添加皮革水解蛋白问题，规范乳制品科学规范生产具有重要意义。

发明内容