[发明专利]4个聋病易感基因联合检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时检测4个聋病易感基因荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术

世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80％患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80％。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。

在目前已经定位和克隆的耳聋相关基因中，GJB2是最常见的易感基因，在先天性重度耳聋患者中约占30-50％。目前，在该基因已经发现了100多种突变类型，然而，不同种族GJB2基因常见的突变形式不同。在中国常见的突变形式为235delC，其在所有致病性突变中约占74.14％，约22.2％的中国耳聋患者与该突变有关。

药物的耳毒性是导致语前听力损失的一个重要因素，部分与线粒体12S rRNA基因1555A＞G突变有关，该突变可以增加耳蜗对氨基糖甙类药物的敏感性。在美国，耳毒性药物相关的听力损失患者中，10％的具有12S rRNA基因1555A＞G突变，美国语前听力损失患者中，1555A＞G突变患者的发病率约为1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因1555A＞G突变与15-20％的家族性非综合征型听力损失有关，许多年老的家族成员即使没有使用氨基糖甙类药物也可发生因此突变导致的听力下降。而在中国，药物性耳聋的发病率超出了原有的想象，在一系列的文章报道中，发现在门诊散发的耳聋患者中，约5％的患者是由于12S rRNA基因1555A＞G突变导致的，而在聋哑学校这样一个特殊群体，则高达12％的患者是由于12SrRNA基因1555A＞G突变接触氨基糖甙类药物而致聋。同时在中国群体中还发现了12S rRNA基因1494C＞T突变与药物性耳聋的关系，目前至少已经发现了三个大的家系是由于1494C＞T突变导致的。1555A＞G突变和1494C＞T突变者在出生时往往听力正常，很难通过听力筛查而被提前发现和预测，却存在因耳毒性药物的使用而发生听力损失的隐患。

SLC26A4基因与弧立的大前庭水管综合征及Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)的关系密切，临床上表现为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。通过颞骨CT扫描可以得出结论，但目前由于设备和专业人员的限制，中国大部分地区的医院不能进行高分辨率的颞骨CT扫描，导致许多地区无法诊断大前庭水管综合征。通过对SLC26A4基因的检测，则可以在全国范围内实现对80％以上大前庭水管综合征的准确诊断，并先于CT检查发现和确诊大前庭水管综合征，这一方法可以避免放射线检查的辐射问题，更易为患者家属接受，并且由于基因诊断操作能够批量进行，可以在大标本范围内进行筛查。大量研究表明，存在于中国人群突变热点区域为：SLC26A4基因外显子8的侧翼序列的IVS7-2A＞G。

目前常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。

采用荧光标记技术、毛细管电泳技术、多重PCR复合扩增，通过带不同荧光标记物的多对引物同时对GJB2235delC、12S rRNA 1555A＞G突变、1494C＞T突变、IVS7-2A＞G特异性的扩增，并在这些引物中掺入核酸类似物以提高引物的Tm值，进一步增强引物的特异性，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对这4个耳聋基因位点的同时检测。该方法灵敏度高、判读清晰准确、采样方便，并能实现一次性获得4个关键位点诊断结果的高通量筛查流程，大大节约了人力物力和时间、防止多步操作而产生污染。

发明内容