[发明专利]一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞遗传学和分子生物学领域，涉及一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法。

背景技术

荧光原位杂交(FISH)技术是70年代初开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是将DNA用特殊修饰的核苷酸分子标记(如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP)，根据核酸分子碱基互补配对原则与染色体上相应的序列杂交。进行原位杂交时，先用高温或碱处理DNA分子，使之发生变性；当温度下降或pH值恢复到中性，变性的DNA会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只有它们之间的碱基序列是同源互补或部分同源互补时，才能全部或部分复性，产生分子杂交。由于探针带有荧光物质，因此杂交的位点可直接在荧光显微镜下观察到。利用该技术可以检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。

随着技术的发展与不断完善，荧光原位杂交在植物上应用于研究的优越性越来越明显：(1)与用放射性物质来标记探针的分子原位杂交相比，它不需要反射性同位素，安全可靠，不需特殊方法处理，检测时间短，背景清晰，检测灵敏度高，底物可长期贮存而不失活；(2)与其它非放射性原位杂交技术相比，它可用不同荧光素标记的探针与同一目的DNA进行杂交，即进行多重标记，一次定位多个DNA序列；(3)杂交信号可逐级放大，进行定量或非定量分析，并且可听过计算机软件图像分析系统检测并处理杂交微弱的信号，使其可视化更强。

因此，以45S rDNA、5S rDNA或植物全基因组为探针的荧光原位杂交在研究动植物系统发育与进化、识别个别染色体、提高同源染色体配对准确性、进一步阐明染色体结构变异等重要的遗传学问题以及鉴定杂种和检测后代外源染色体或染色体片段存在与否等研究领域具有重要应用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法。本发明的杂交方法是采用中期染色体作为靶DNA，进行原位杂交。其技术方案为：

一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法，包括以下步骤：

1)制片：取悬钩子根尖，预处理，固定，然后用1mol·L^-1HCl在60±0.5℃下解离40s，压片，液氮冻片，干燥；

2)制备探针：提取选自悬钩子植物基因组DNA或通过PCR，得到目的片段45S rDNA或5S rDNA，用荧光素进行标记，制得探针；

3)杂交前预处理：依次用2％纤维素酶和2％果胶酶混合液、100μg·mL^-1的DNase-free RNase A、1mg·mL^-1的蛋白酶K和45％醋酸处理，再用4％多聚甲醛固定，然后依次用75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；

4)制备杂交液：杂交液总体积为30μL：100％去离子甲酰胺15μL；50％硫酸葡聚糖6μL；20×标准柠檬酸盐3μL；10％十二烷基磺酸钠1μL；荧光素标记的探针3μL；封阻DNA1μL；不足30μL时用灭菌去离子水补足；将杂交液混匀，于100℃变性5min，转入冰上处理至少10min；

5)制片变性：将制片于70％甲酰胺中70℃变性3min，转入经-20℃冰冻的75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；

6)杂交：将杂交液滴于制片上，加盖玻片，封片，于37℃细胞恒温培养箱中杂交过夜；

7)检测：用标准柠檬酸钠盐洗脱，然后加与标记用的荧光素匹配的抗体衬染，观察荧光信号，采集并加工杂交图像。

其中上述步骤1)中所述的预处理是用0.002mol·L^-18-羟基喹啉在4℃下处理4h或重蒸馏水在4℃下处理24h，固定是采用卡诺氏固定液I(无水乙醇∶乙酸＝3∶1，v/v)在4℃下固定24h，压片是用45％乙酸处理。

步骤2)中所述荧光素选用地高辛，所述探针的浓度为20～100ng·μL^-1。

步骤3)中所述的2％纤维素酶和2％果胶酶混合液处理是在37℃下温育1.5h，DNase-free RNaseA处理是在37℃下温育1h，蛋白酶K处理是在37℃下温育30min，45％醋酸处理是在室温下处理5min，多聚甲醛处理是在室温下固定10min，乙醇脱水时间为每级5min。

步骤4)中所述的杂交液变性是在PCR仪或沸水中进行。

步骤5)中所述的70％甲酰胺是用2×标准柠檬酸盐稀释，所述的-20℃冰冻乙醇脱水时间为每级5min。