[发明专利]一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法

权利要求书

1.一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制片：取悬钩子根尖，预处理，固定，然后用1mol·L^-1 HCl在60±0.5℃下解离40s，压片，液氮冻片，干燥；

2)制备探针：提取选自悬钩子植物基因组DNA或通过PCR，得到目的片段45S rDNA或5S rDNA，用荧光素进行标记，制得探针；

3)杂交前预处理：依次用2％纤维素酶和2％果胶酶混合液、100μg·mL^-1的DNase-free RNaseA、1mg·mL^-1的蛋白酶K和45％醋酸处理，再用4％多聚甲醛固定，然后依次用75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；

4)制备杂交液：杂交液总体积为30μL：100％去离子甲酰胺15μL；50％硫酸葡聚糖6μL；20×标准柠檬酸盐3μL；10％十二烷基磺酸钠1μL；荧光素标记的探针3μL；封阻DNA1μL；不足30μL时用灭菌的去离子水补足；将杂交液混匀，于100℃变性5min，转入冰上处理至少10min；

5)制片变性：将制片于70％甲酰胺中70℃变性3min，转入经-20℃冰冻的75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；

6)杂交：将杂交液滴于制片上，加盖玻片，封片，于37℃细胞恒温培养箱中杂交过夜；

7)检测：用标准柠檬酸钠盐洗脱，然后加与标记用的荧光素匹配的抗体衬染，观察荧光信号，采集并加工杂交图像。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的预处理是用0.002mol·L^-18-羟基喹啉在4℃下处理4h或重蒸馏水在4℃下处理24h，固定是采用卡诺氏固定液I：无水乙醇∶乙酸＝3∶1，v/v，在4℃下固定24h，压片是用45％乙酸处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的2％纤维素酶和2％果胶酶混合液处理是在37℃下温育1.5h，DNase-free RNase A处理是在37℃下温育1h，蛋白酶K处理是在37℃下温育30min，45％醋酸室温处理5min，多聚甲醛处理是在室温下固定10min，乙醇脱水时间为每级5min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的杂交液各个成分的比例：100％去离子甲酰胺15μL；50％硫酸葡聚糖6μL；20×标准柠檬酸盐3μL；10％十二烷基磺酸钠1μL；荧光素标记的探针3μL；封阻DNA 1μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述的70％甲酰胺是用2×标准柠檬酸盐稀释，所述的-20℃冰冻乙醇脱水时间为每级5min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述的杂交过夜是密封避光，杂交时间为18h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)中所述的洗脱是用20％甲酰胺0.1×SSC 42℃处理制片10min，再依次用2×SSC缓冲液和0.2％Tween，用2×SSC稀释，洗5min，标记用的荧光素匹配的抗体浓度为5μg·mL^-1，在37℃下处理1h。