[发明专利]检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒，属于单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检验检疫领域。 

背景技术

随着世界经济全球化、贸易自由化和食品国际贸易的迅速发展，食品安全已成为事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题。而食源性疾病在食品安全问题中又占据非常重要的地位。WHO将食源性疾病定义为存在于自然界中的有污染性或毒性的因子(包括病毒、寄生虫、细菌和农业、环境、危险化学品以及生物毒素)通过进食而进入身体引起的疾病(任玉华，田海霞.食品安全与食源性疾病[J].职业与健康，2005，21(12)：1977-1978.)。爆发的食源性疾病中多数是由致病性细菌引起(张敏，童华荣，张丽平.动物性食品安全现状及其对策[J].食品工业科技，2005(5)：182-186)。其中，单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌是比较重要的两种食源性致病菌(刘圆圆.沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌的同步快速检测方法的研究[D].华南理工大学，2010，1-86)。 

单增李斯特菌是一种能引起人畜共患的致病菌，致死率高达30％，对于免疫缺陷病人致死率甚至高达70％。该菌在欧美日等发达国家的危害程度甚至超过沙门氏菌食物中毒。根据美国疾病控制中心的研究报告估计，美国每年有7600万人食物中毒，约有5000人死于食物中毒，其中单增李斯特菌、出血性大肠杆菌O157:H7和多种抗生素耐药性鼠伤寒沙门氏菌引起的食源性疾病最为突出(张兰荣，唐一清，甄博珺，等.通州区6类食品单增李斯特菌污染状况及分子流行病学特征调查研究[J].中国卫生检验杂志，2007，17(12)：2306-2308)。WHO关于单增李斯特菌食品中毒报告中指出，各类产品中，新鲜肉类及肉类制品中含有单增李斯特菌的比例最高(何欣荣等，2002)。 

金黄色葡萄球菌是人和动物的常见病原菌，在自然界中无处不在。在美国，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒33％，加拿大则更多，占45％。中国每年发生的此类中毒事件也非常多。2003年 中国食源性疾病暴发的监测资料分析显示，在微生物食源性疾病爆发中，金黄色葡萄球菌占9.4％，仅次于副溶血弧菌和变形杆菌。且报道显示，引起食源性疾病的动物类食品中以肉及肉制品最多，高达68％(刘秀梅，陈艳，樊永祥，等.2003年中国食源性疾病暴发的监测资料分析[J].卫生研究，2006，35(2)：201-204)。 

有鉴于此，开展食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌同步、快速检测方法的研究具有重要意义。目前较为常用的检测方法是传统分离鉴定方法和普通PCR方法。但传统的分离鉴定方法，操作繁琐，耗时耗力，不能满足快速检测的需求(Churchill R L T，Lee H，Hall J C.Detection of Listeriamonocytogenes and the toxin listeriolysin O in food.Journal of M icrobiological Methods，2006，64(2)：141～170)。常规PCR法需要琼脂糖凝胶电泳后续处理，费时费力，还增加了对环境造成污染的可能性。迄今为止，尚缺乏一种灵敏性高、稳定性好的能够同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒及检测方法。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒； 

本发明的目的之二是提供一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法； 

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒，包括：Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物和一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针。 

其中，所述的一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的一条检测单增李斯特菌 的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，在SEQ ID No.3所示探针的5′端连接有荧光报告基团，3′端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是FAM，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。