[发明专利]检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒，包括：Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物和一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针；其特征在于：所述的一对扩增单增李斯特菌引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的检测单增李斯特菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述的一对扩增金黄色葡萄球菌引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述的检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。

2.按照权利要求1所述的的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的荧光定量PCR扩增缓冲液中含有dNTPs和Mg²⁺ 。

3.按照权利要求1所述的的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

    在SEQ ID No.3所示探针的5′端连接有荧光报告基团，3′ 端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是FAM，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse；

    在SEQ ID No.6所示探针的5′端连接有荧光报告基团，3′ 端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是JOE，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。

4.按照权利要求1-3任何一项所述的的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：含有单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌标准质粒；此外，该试剂盒还含有阴性质控标准品。

5.一种同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法，包括以下步骤：（1）提取待检测食品的DNA；（2）建立PCR扩增体系：所提取的待检测食品的DNA，Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物和一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针；（3）将所建立的PCR扩增体系在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，根据扩增曲线、标准曲线或/和Ct值对样品中的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌进行定性或定量分析；其中，所述的一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的检测单增李斯特菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述的一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述的检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。

6.按照权利要求5所述的双重荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR扩增缓冲液中含有dNTPs和Mg²⁺ ; 

在SEQ ID No.3所示探针的5′端连接有荧光报告基团，3′ 端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是FAM，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse；

在SEQ ID No.6所示探针的5′端连接有荧光报告基团，3′ 端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是JOE，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。

7.按照权利要求5所述的双重荧光定量PCR方法，其特征在于：

 所述的定性分析包括以下步骤：设定阈值；如果PCR扩增曲线超过设定的阈值即为阳性，说明待检测样品中检测到单增李斯特菌或金黄色葡萄球菌；如果PCR扩增曲线在阈值线以下即为阴性，说明待检测样品中没有检测到单增李斯特菌或金黄色葡萄球菌；

    所述的定量分析包括以下步骤: 建立标准曲线：将阳性标准单增李斯特菌模板或阳性标准金黄色葡萄球菌模板进行梯度稀释后进行PCR扩增， 以标准阳性模板的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标分别建立单增李斯特菌或金黄色葡萄球菌的标准曲线；

    按照阳性标准模板相同的PCR扩增体系和扩增条件，将待扩增的样品进行PCR扩增，确定Ct值；通过标准曲线和所确定的Ct值对检测样品进行定量分析。