[发明专利]一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法

权利要求书

1.一种使用复合增强子以提高Bt融合蛋白在汉逊酵母表达量的方法。

2.如权利要求1中的方法，其中所说的复合增强子具有序列表中的1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1中的方法，编码Bt融合蛋白的DNA序列，其特征在于具有序列表3中所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1中的方法，需构建一种表达质粒载体，其特征在于它含有权利要求2所述的复合增强子序列及权利要求3中所述的编码Bt融合蛋白的DNA序列。

5.如权利4中所述的表达载体，其特征在于，在构建表达载体时，采用的起始载体为pPIC9K或其他能够组成型表达并分泌重组蛋白到胞外的质粒载体。

6.如权利要求1中的方法，需要一种酵母宿主细胞，其特征在于它包含权利要求4和5中所述的表达载体。

7.如权利要求6中所述的宿主细胞，它是指汉逊酵母菌株A16或其他能够表达外源基因的酵母菌株。

8.利用权利要求7所述的汉逊酵母菌株A16高效表达和生产Bt重组融合蛋白的方法，其中包括了四个阶段：

1)种子液制备：挑取酵母单菌落，接种于10mL YPD液体培养基中，37℃振荡培养过夜后，将该培养物转接于100mL YPD培养基中，37℃振荡培养24小时后，将该培养物转接于3L BMGY培养基中，37℃振荡培养48小时，然后将其作为种子液；

2)初培养阶段：在20L发酵罐中盛放了10L基础发酵培养基[10×Basal Salts：2.67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾+4％甘油]，在接种前先加入氨水使该培养基的pH值维持在4.0左右，再按照下述比例，在每升基础发酵培养基中加入4.37mL微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜，0.008％碘化钠，0.3％硫酸锰，0.02％钼酸钠，0.002％硼酸，0.05％氯化钴，2％氯化锌，6.5％硫酸亚铁，0.025％生物素，0.5％硫酸)。按占基础发酵培养基体积10％的比例接种此前制备好的种子液，37℃通气搅拌(转速自始至终维持在375转/分)培养24小时左右；

3)蛋白大量表达阶段：从接种后的第二天，通过蠕动泵流加补料液，补料液为50％甘油(其中含有12mL PTM1/L)，流加量为18mL/L/天。37℃通气搅拌培养至72h，用氨水维持pH值在4.0左右，同时调整通气量使此阶段的溶氧量始终维持在20％以上。

4)发酵液经5000rpm 4℃离心10分钟，留取上清。用截流分子量为10KDa的纳滤膜处理上清液，保留回流液。用蒸馏水将回流液稀释10倍，然后再通过10KDa的纳滤膜处理，如此重复操作5次。将回流液冷冻干燥后，可得到初步提纯的Bt重组蛋白冻干粉。将其重新悬浮于50mL的20mMTris-HCl缓冲液中(pH7.9，含5mM咪唑，0.5M NaCl)。准备20mL的镍柱，首先用无菌水洗柱(10倍柱床体积)，流速1mL/mim，然后用上样缓冲液I(10mM Tris-HCl，pH7.9，含0.25M NaCl)进行平衡(10倍柱床体积)，流速为1mL/min。将上述蛋白样品液以1mL/min的速度加入到柱子中。用上样缓冲液I继续平衡(10个柱床体积)，然后分别用含有50mM、100mM及400mM咪唑的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9，含0.25MNaCl)进行洗脱，流速为2mL/min，收集含Bt目标蛋白阶段的洗脱液，汇合后冻干。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述的Bt重组融合蛋白经高度纯化后可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。