[发明专利]一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽药对照品试剂制备领域，具体涉及一种黄霉素预混剂中提取、纯化黄霉素A对照品的方法。

背景技术

黄霉素为磷酸化多糖类抗生素，具有抗菌作用机理，是通过干扰细菌细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成从而抑制细菌的繁殖，黄霉素的促生长原理可能在他能提高饲料中能量和蛋白质的消化，能使肠壁变薄，从而提高营养物质的吸收，能有效地持续肠道菌群的平衡和瘤胃pH值的稳定。细菌对黄霉素不易产生耐药性，黄霉素也不容易与其他抗生素产生交叉耐药性。

黄霉素主要包括黄霉素A、B1、Ba和C等，其中黄霉素A为主要有效成分，占50%以上。黄霉素只用作饲料添加剂，不作为治疗用药，具有抗生素类添加剂的防病和促生长等作用。黄霉素抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效，且对其他抗生素耐药性的革兰氏阳性菌也有效，但对革兰氏阴性菌作用很弱。对牛，猪、鸡、兔都有促生长、提高饲料转化率的作用。美国FDA规定：肉鸡每吨饲料添加1～2g，火鸡为每吨1～2g，猪为每吨2～4g。日本每吨鸡饲料添加0.5～5g，腐乳猪为5～10g，仔猪为1～10g。

现有黄霉素对照品为生物发酵法制备，黄霉素A纯度不高，约50%～70%左右，含有黄霉素B1、Ba和C等副产物，不适用于黄霉素A残留检测使用。本发明从黄霉素预混剂中提取纯化的黄霉素A对照品，纯度高达93%～99％，杂质少，步骤简便，成本低廉，主要应用于黄霉素残留检测领域。

黄霉素A对照品的用途，即本发明的推广应用前景：持续使用抗生素所引起的畜产品抗生素残留以及动物和人类出现耐药性问题已经越来越为人们所重视。20世纪80年代以来，越来越多的国家立法禁止滥用抗生素。畜禽饲料中慎用抗生素原则和限制抗生素促进生长剂，必定是未来养殖业发展的趋势。1997年联合国粮农组织（FAO）要求停止或禁止抗生素饲料添加剂。1998年12月又提议在10年内淘汰抗生素饲料添加剂。目前，联合国FAO，WTO组织及发达国家特别规定人用抗生素不得用于动物，对使用抗生素有极严格的要残限制，甚至完全不准使用。欧盟已经决定从2006年1月起，禁止在饲料中使用莫能霉素（monensin），盐霉素（salinomycin），卑霉素（Avilamycin），黄霉素（Flavophospholipol）等4种生长促进因子类抗生素，这意味着欧盟将会全面禁止在饲料中投放任何种类的抗生素。在日本肯定表制度中，黄霉素没有规定畜禽肌肉及内脏残留限量，按照“一律标准”原则，即没有规定残留限量的化合物一律按10μg/kg限量来执行，黄霉素的残留限量为10 μg/kg。动物源性食品中抗生素残留的检出，已成为世界肉类贸易中重要的技术指标和技术壁垒之一。由于黄霉素在我国养殖业广泛使用，欧盟、日本等国家对我国出口动物产品的药物残留限制提出了更严格的要求，必将对我国动物源性食品出口带来了严重影响。为了突破抗生素残留限制的技术壁垒，对畜禽产品中黄霉素残留进行检测和监控，制备高纯度的黄霉素A对照品显得非常必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种从黄霉素预混剂中提取纯化黄霉素A对照品的方法，利用该方法制备的黄霉素A纯度达到93%以上。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法，包括如下步骤：

（1）提取

以每mL甲醇与0.4g黄霉素预混剂的比例混合二者并加入离心试管中，将离心试管置于超声提取器中，超声提取30min，每10min振荡一次，8000转/min下离心3min，将上清液转移至旋转蒸发瓶中；在残渣中加入甲醇按照上述步骤，重复提取2次；合并每次提取的上清液，40℃水浴旋转蒸发浓缩至干，得到提取物。

（2）SPE纯化

依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化C₁₈固相萃取小柱，控制流速为1～2mL/min；将提取物用10mL超纯水溶解，并全部加于固相萃取小柱上，并挤干柱床上的水分，依次用4mL5%甲醇溶液、4mL正己烷与二氯甲烷的混合溶液、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯与甲醇的混合溶液淋洗除杂；最后用6mL甲醇将黄霉素从固相萃取小柱中解析，将解析液于40℃水浴旋转蒸发浓缩至干，得到黄霉素纯化产物；将纯化产物转移至称量皿中，-75℃真空冷冻干燥5h，即得黄褐色黄霉素A粗产品。

（3）HPLC纯化

称取黄霉素A粗产品，用流动相溶解并稀释成2～10mg/mL，过0.45mm滤膜，按下列条件分离纯化，收集洗脱液。

分离纯化条件：