[发明专利]一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法

权利要求书

1.一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法，包括如下步骤：

（1）提取

以每mL甲醇与0.4g黄霉素预混剂的比例混合二者并加入离心试管中，将离心试管置于超声提取器中，超声提取30min，每10min振荡一次，8000转/min下离心3min，将上清液转移至旋转蒸发瓶中；

在残渣中加入甲醇按照上述步骤，重复提取2次；

合并每次提取的上清液，40℃水浴旋转蒸发浓缩至干，得到提取物；

（2）SPE纯化

依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化C₁₈固相萃取小柱，控制流速为1～2mL/min；将提取物用10mL超纯水溶解，并全部加于固相萃取小柱上，并挤干柱床上的水分，依次用4mL5%甲醇溶液、4mL正己烷与二氯甲烷的混合溶液、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯与甲醇的混合溶液淋洗除杂；最后用6mL甲醇将黄霉素从固相萃取小柱中解析，将解析液于40℃水浴旋转蒸发浓缩至干，得到黄霉素纯化产物；将纯化产物转移至称量皿中，-75℃真空冷冻干燥5h，即得黄褐色黄霉素A粗产品；

（3）HPLC纯化

称取黄霉素A粗产品，用流动相溶解并稀释成2～10mg/mL，过0.45mm滤膜，按下列条件分离纯化，收集洗脱液；

分离纯化条件：

色谱柱：Agela Technologies Venusil MP C18，250 mm × 4.6 mm，5 mm;

柱温：30℃；

流动相：0.2%甲酸铵：乙腈，体积比为55:45；

流速：1.0mL/min；

进样量：50 mL；

检验波长：258nm；

（4）浓缩、干燥

将收集的洗脱液减压浓缩去除乙腈，得到浓缩液；控制流速1～2 mL/min，将浓缩液全部过C₁₈固相萃取小柱；用10mL超纯水淋洗C₁₈固相萃取小柱；用10mL甲醇解析C₁₈固相萃取小柱，直至解析液中没有黄霉素A；将收集解析液在40℃水浴下氮吹仪浓缩至干，转移至称量皿后真空冷冻干燥，即得淡黄色的黄霉素A对照品；

（5）纯度鉴定

称取一定量的黄霉素A对照品，用水溶解，用紫外分光光度计测定258nm下的吸光度，计算黄霉素A的纯度。

2.根据权利要求1所述一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法，其特征是:步骤（2）中所述正己烷与二氯甲烷的混合溶液中二者的体积比为1:1；所述乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中二者的体积比为3:1。

3.根据权利要求1所述一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法，其特征是:步骤（3）中收集洗脱液应在黄霉素A色谱峰达到检测器20秒后开始，完全通过检测器后10秒结束。

4.根据权利要求1所述一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法，其特征是:步骤（5）中黄霉素A的纯度达到93%～99％。