[发明专利]一种从绵羊毛囊组织中提取总RNA的方法

说明书

技术领域：

本发明属于RNA制备技术领域，具体涉及一种从绵羊毛囊组织中提取总RNA的方法。

背景技术：

RNA是一种多功能分子，它作为DNA转录的产物及蛋白质的翻译模板，与DNA、蛋白质及RNA本身都存在许多互作。不同的RNA在生化过程中充当着信使、酶及结构组分等多种角色，在生命活动的各环节发挥着重要的作用。随着生物技术及计算机技术的不断发展，越来越多的方法可用于RNA的检测与研究，RNA种类及功能的多样性也不断的被发现。随着研究的深入，人们也意识到RNA的研究在揭示生命过程本质及疾病治疗等方面都有着重要意义。

欲对RNA进行研究，首先要从组织中提取得到高质量的RNA。但RNA与DNA不同，极容易发生降解，RNA降解将对后续研究的真实性及可靠性产生极大的影像。引起RNA降解的主要因素是RNA酶(章国卫等，真核细胞中mRNA的降解机制；遗传；1999，21(6)：49-53.)。RNA酶有2种来源，一种是外源性的，一种是内源性的。因此在采集用于RNA提取的样品时，重点就在于如何防止外源性RNA酶污染及抑制内源性RNA酶活性上。外源性RNA酶可以通过DEPC等RNA酶抑制剂处理实验用品以及严格的实验操作和试验环境的控制来加以排除。而内源性RNA酶却很难去除，只能通过液氮或干冰制造低温或者组织样品保护液浸泡的方法来进行抑制(Mutter，G.L. et al.(2004).Comparison of frozen and RNALater solid tissue storage methods for use in RNA expression microarrays.BMC Genomics.5：88)。但对于某些组织来说，这样的处理很难达到预期效果，比如毛囊组织。

由于毛囊组织体积极小，使用液氮冻存后不方便研磨，且角质化程度高，使用组织样品保护液无法快速渗透到组织内部，起不到抑制RNA酶的效果。这些都是影响毛囊组织RNA提取产量及质量的重要因素，特别是在野外现场对绵羊等动物进行毛囊采集时这种问题尤为明显，这些问题都阻碍了对毛囊组织基因RNA水平表达研究的进展。本发明就是为了解决以上难题而提供了一种从现场样品采集开始，包括样品运输、保存，到RNA提取的绵羊毛囊组织RNA提取方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种获得高质量RNA的方法。本发明提取的绵羊毛囊组织总RNA，不被外源或内源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的总RNA的纯度，以利于后续试验的利用。本发明操作简单方便，成本低，无需液氮和RNA样品保护液。本发明获得的毛囊组织总RNA纯度高、完整度好，可用于反转录cDNA、PCR、QPCR等下游操作及mRNA与microRNA的检测等分子生物学的操作应用。

实现本发明的技术方案如下所述：

(1)现场采集毛囊组织及处理：

a)在活体状态下，从绵羊体侧成股拔取羊毛，用剪刀在距离羊毛根部毛囊泡1cm处将羊毛剪断，收集毛囊至装有700μL TRIzol的1.5mL锥形底离心管中，收集量至毛囊组织总体积占TRIzol液体体积的1/3即可；

b)立刻用小型塑料研磨杵在离心管内研磨1min，向离心管内补充300μL TRIzol使1.5mL离心管内的TRIzol总量达1mL，盖好盖子甩动离心管让毛囊完全浸泡在TRIzol液体中，将离心管放入离心管盒内，即完成采集；

c)在避光条件下，于24小时内将研磨后装有样品的离心管放入-20℃暂时冻存。

(2)样品运输：

将装有样品的离心管从-20℃取出放入泡沫盒，同时放入足够量的冰袋，密封后进行运输，使运输过程中的冰袋不完全融化为准。

(3)样品保存

在室温下解冻浸泡在TRIzol中的样，于4℃12000rpm离心10min，吸取TRIzol液体至新离心管，此时，TRIzol液体可放入-80℃保存，至少1个月毛囊RNA不会降解。

(4)RNA提取：

a)在室温下解冻由步骤(3)中冻存的TRIzol样品液体，向每1mL TRIzol样品中加入200μL氯仿，剧烈震荡混匀20s，室温静置5min；

b)于4℃ 12000rpm离心15min，取400μL所得上清至新离心管；

c)向所得上清中加入400μL异丙醇，上下颠倒混匀10次，室温静置10min；