[发明专利]利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法。

背景技术

胆囊结石病是目前全世界范围内最常见的消化系统疾病之一，随着发病率的日趋增加，严重影响人民的健康和生活质量。近年来胆囊结石成因的研究有了较大进展，如乔铁等报道了华支睾吸虫与胆囊结石有密切相关性，但目前对胆囊结石的形成机制仍不十分明了，尚未对华支睾吸虫与胆囊结石形成机制之间的关系进行DNA水平上的研究，但也可通过研究胆囊胆汁DNA来进行研究。

发明内容

针对以上要解决的技术问题，本发明的目的在于提供一种利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法，从而为探讨华支睾吸虫卵与胆囊胆汁形成机制的关系提供新的角度和方向。

为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所述的利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法，其具体步骤包括：

1)胆囊胆汁预处理；

2)提取胆囊胆汁中的DNA；

3)设计并合成特异性引物及探针：根据华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因序列，设计并合成如下特异性的引物及探针：

正向引物序列：5′-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3′；

反向引物序列：5′-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3′；

探针序列：5′-(JOE)-AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC-(BHQ-1)-3′；

将以上引物及探针配制成浓度为10μM的储存液，-20℃保存；

4)实时荧光PCR反应。

根据本发明提供的检测方法，所述步骤1)中，胆囊胆汁预处理的具体步骤如下：

A)取胆囊胆汁500μl置于2.0ml Ep管中，12000rpm离心10分钟，向沉渣中加入1ml生理盐水，混匀后12000rpm离心10分钟，弃上清；

B)向胆囊胆汁沉渣中加入1ml 80v/v％乙醇，混匀后静置5分钟，12000rpm离心10分钟弃上清；

C)重复步骤B)；

D)向步骤C)所得的胆囊胆汁中加入1ml生理盐水，12000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉渣。

根据本发明提供的检测方法，所述步骤2)中提取胆囊胆汁中的DNA的具体步骤为：使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取胆汁DNA，再用100μl AE溶液溶解所提取的DNA，-20℃保存。

根据本发明提供的检测方法，所述步骤4)中实时荧光PCR反应的具体步骤如下：

a)在冰上配制PCR反应体系，依次加入以下试剂：Premix Ex Taq^TM25μl、正向引物溶液1μl、反向引物溶液1μl、探针溶液1μl、ROX液1μl、胆汁DNA 2μl，然后再加蒸馏水至总体积为50μl；

b)设置PCR反应条件：第一步95℃预变性30秒，第二步95℃变性15秒，60℃退火延伸31秒，共计45个循环。

与现有技术相比，本发明通过实时荧光PCR技术，能够高效地提取胆囊胆汁中华支睾吸虫的DNA，并且无需电泳，可以节省检测时间，灵敏度高，并有效避免有毒物质(如EB)的污染，为探讨华支睾吸虫卵与胆囊胆汁形成机制的关系提供了新的研究角度和方向。

附图说明

图1是对华支睾吸虫、弓形虫、日本血吸虫、广州管圆线虫、蛔虫的DNA及阴性对照的实时荧光PCR特异性分析结果比较。

图2是本发明实时荧光PCR灵敏度检测结果。

图3是Ct值与华支睾吸虫DNAi0倍浓度梯度稀释的相关性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1胆囊胆汁的获取

喉罩全身麻醉，迷你腹腔镜直视右肋缘下小切口抓取胆囊，胆囊底部微小切口(＜6mm)，用无菌脑室引流管引流胆汁至连接的无菌注射器中，再转移至无菌试管中。

实施例2胆囊胆汁DNA的提取