[发明专利]利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法

权利要求书

1.一种利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)胆囊胆汁预处理；

2)提取胆囊胆汁中的DNA；

3)设计并合成特异性引物及探针：根据华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因序列，设计并合成如下特异性的引物及探针：

正向引物序列：5′-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3′；

反向引物序列：5′-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3′；

探针序列：5′-(JOE)-AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC-(BHQ-1)-3′；

将以上引物及探针配制成浓度为10μM的储存液，-20℃保存；

4)实时荧光PCR反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，胆囊胆汁预处理的具体步骤如下：

A)取胆囊胆汁500μl置于2.0ml Ep管中，12000rpm离心10分钟，向沉渣中加入1ml生理盐水，混匀后12000rpm离心10分钟，弃上清；

B)向胆囊胆汁沉渣中加入1ml 80v/v％乙醇，混匀后静置5分钟，12000rpm离心10分钟弃上清；

C)重复步骤B)；

D)向步骤C)所得的胆囊胆汁中加入1ml生理盐水，12000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉渣。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中提取胆囊胆汁中的DNA的具体步骤为：使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取胆汁DNA，再用100μl AE溶液溶解所提取的DNA，-20℃保存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中实时荧光PCR反应的具体步骤如下：

a)在冰上配制PCR反应体系，依次加入以下试剂：Premix Ex Taq^TM25μl、正向引物溶液1μl、反向引物溶液1μl、探针溶液1μl、ROX液1μl、胆汁DNA 2μl，然后再加蒸馏水至总体积为50μl；

b)设置PCR反应条件：第一步95℃预变性30秒，第二步95℃变性15秒，60℃退火延伸31秒，共计45个循环。