[发明专利]用于解离Fcgamma-受体-IgG复合物及纯化与检测IgG的方法和试剂盒

说明书

本申请是申请日为2008年9月11日、申请号为“200880115576.5”、发明名称为“用于解离Fcgamma-受体-IgG复合物以及纯化与检测IgG的方法和试剂盒”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分离细胞群、用于分离和评价IgG的方法、用于分离IgG的Fab或Fc片段的方法以及用于实施所述方法的试剂盒。

背景技术

抗体的免疫球蛋白G(IgG)类在人宿主抵抗病原体的适应性免疫防御中起着重要作用。IgG由两条相同的重链和两条相同的轻链构成，而重链和轻链由可变区和恒定区组成。IgG分子经木瓜蛋白酶处理可生成识别抗原的Fab片段和作为宿主受体的识别位点和与多个效应分子相互作用的位点的Fc片段。

IgG的Fc部分还含有与各重链的C_H2结构域中天冬酰胺297残基连接的保守的复合糖或聚糖。当IgG是其天然形式时，这些聚糖位于C_H2结构域之间的相接处。它们由具有添加的末端及支链糖残基(例如N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、唾液酸以及半乳糖)的N-乙酰葡糖胺和甘露糖的二天线核心(biantennary core)构成。该糖的存在对于正确的抗体结构以及与细胞免疫球蛋白G Fcγ受体(FcγR)和补体系统的相互作用来说至关重要。

内切糖苷酶S(EndoS)由化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)分泌，通过水解与IgG重链上的天冬酰胺297残基连接的保守聚糖而对天然IgG具有特异性内切糖苷酶活性。EndoS是第一种已知对天然IgG具有专一特异性的细菌酶。相比之下，其他已知的内切糖苷酶的活性需要对糖蛋白底物进行变性，或通过对糖蛋白底物进行变性而加强。

诸如IgG的抗体在基础研究以及在诊断和药物开发中具有许多应用。在一些应用中，诸如，在免疫组织化学、免疫测定、肿瘤检测、放射疗法、抗体结合位点和免疫靶向的晶体学研究中，使用Fab片段要比使用完整的IgG分子方便。使用Fab片段的一些优点是它们不会受到细胞上的Fc受体或沉淀抗原影响，它们表现出免疫原性降低和对吞噬作用较不敏感，并且放射性标记的Fab片段比完整的IgG分子被更快速地从组织中清除。对于其他应用，使用IgG的Fc片段是合乎需要的。

如果要大规模制备Fab或Fc片段，可以以重组蛋白的形式进行制备。为了纯化的目的，通常制备重组IgG和血清IgG的完整分子，然后进行化学处理以获得Fab或Fc片段。

最常使用诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的蛋白水解酶将IgG切成Fab和Fc片段。这些酶经常切割其他蛋白，所以切割反应通常必须对纯化的IgG级分进行。另外，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶通常在多处切割IgG。这意味着所获得的片段经常不对应于完整的Fab或Fc片段，即使切割确实产生Fab和Fc片段，它们也通常容易进一步切割成更小的片段。通常使用蛋白A或G亲和分离柱来进行Fc片段与Fab片段的分离，该分离柱利用了细菌蛋白A和G的Fc结合特性。

发明内容

本发明人获得了下述令人惊讶的发现，使细胞与EndoS接触去除已经与FcγR结合的IgG。根据本发明，由此提供了一种体外解离Fcγ-受体-IgG复合物的方法，所述方法包括：使该复合物与EndoS多肽接触，由此获得不与IgG结合的Fcγ-受体，其中，所述Fcγ-受体-IgG复合物可随意地存在于含有细胞的样品中。本发明还提供了一种用于分离基本不含Fcγ-受体-结合的IgG分子的细胞群的方法，所述方法包括：

(a)使含有细胞的样品与EndoS多肽接触；以及

(b)从所述接触过的样品中分离所述细胞；由此获得所述细胞群。

本发明人还确定了用于分离IgG的改良方法。所述方法利用了缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽。本发明人首次揭示了所述修饰的EndoS多肽对于功能活性形式的天然IgG糖蛋白具有专一的特异性。因此，所述方法特别有助于分离糖基化的和/或具有功能活性的IgG。通过将所述修饰的EndoS多肽与能够结合变性和/或去糖基化的IgG的另外IgG结合试剂联合使用，本发明人还确定了一种用于评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性的方法。

因此，根据本发明，提供了一种用于从含有IgG的样品中分离IgG的方法，所述方法包括：(a)使所述含有IgG的样品与缺失IgG内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽接触；(b)从所述接触过的样品中分离所述EndoS；由此获得分离的IgG。